It is a challenge to identify patients who, after undergoing potentially curative treatment for hepatocellular carcinoma, are at greatest risk for recurrence. Such high-risk patients could receive novel interventional measures. An obstacle to the development of genome-based predictors of outcome in patients with hepatocellular carcinoma has been the lack of a means to carry out genomewide expression profiling of fixed, as opposed to frozen, tissue.We aimed to demonstrate the feasibility of gene-expression profiling of more than 6000 human genes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. We applied the method to tissues from 307 patients with hepatocellular carcinoma, from four series of patients, to discover and validate a gene-expression signature associated with survival.The expression-profiling method for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue was highly effective: samples from 90% of the patients yielded data of high quality, including samples that had been archived for more than 24 years. Gene-expression profiles of tumor tissue failed to yield a significant association with survival. In contrast, profiles of the surrounding nontumoral liver tissue were highly correlated with survival in a training set of tissue samples from 82 Japanese patients, and the signature was validated in tissues from an independent group of 225 patients from the United States and Europe (P=0.04).We have demonstrated the feasibility of genomewide expression profiling of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues and have shown that a reproducible gene-expression signature correlated with survival is present in liver tissue adjacent to the tumor in patients with hepatocellular carcinoma.

The advent of targeted therapies in hepatocellular carcinoma (HCC) has underscored the importance of pathway characterization to identify novel molecular targets for treatment. We evaluated mTOR signaling in human HCC, as well as the antitumoral effect of a dual-level blockade of the mTOR pathway.The mTOR pathway was assessed using integrated data from mutation analysis (direct sequencing), DNA copy number changes (SNP-array), messenger RNA levels (quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction and gene expression microarray), and protein activation (immunostaining) in 351 human samples [HCC (n = 314) and nontumoral tissue (n = 37)]. Effects of dual blockade of mTOR signaling using a rapamycin analogue (everolimus) and an epidermal/vascular endothelial growth factor receptor inhibitor (AEE788) were evaluated in liver cancer cell lines and in a xenograft model.Aberrant mTOR signaling (p-RPS6) was present in half of the cases, associated with insulin-like growth factor pathway activation, epidermal growth factor up-regulation, and PTEN dysregulation. PTEN and PI3KCA-B mutations were rare events. Chromosomal gains in RICTOR (25% of patients) and positive p-RPS6 staining correlated with recurrence. RICTOR-specific siRNA down-regulation reduced tumor cell viability in vitro. Blockage of mTOR signaling with everolimus in vitro and in a xenograft model decelerated tumor growth and increased survival. This effect was enhanced in vivo after epidermal growth factor blockade.MTOR signaling has a critical role in the pathogenesis of HCC, with evidence for the role of RICTOR in hepato-oncogenesis. MTOR blockade with everolimus is effective in vivo. These findings establish a rationale for targeting the mTOR pathway in clinical trials in HCC.

Abstract Hepatocellular carcinomas represent the third leading cause of cancer-related deaths worldwide. The vast majority of cases arise in the context of chronic liver injury due to hepatitis B virus or hepatitis C virus infection. To identify genetic mechanisms of hepatocarcinogenesis, we characterized copy number alterations and gene expression profiles from the same set of tumors associated with hepatitis C virus. Most tumors harbored 1q gain, 8q gain, or 8p loss, with occasional alterations in 13 additional chromosome arms. In addition to amplifications at 11q13 in 6 of 103 tumors, 4 tumors harbored focal gains at 6p21 incorporating vascular endothelial growth factor A (VEGFA). Fluorescence in situ hybridization on an independent validation set of 210 tumors found 6p21 high-level gains in 14 tumors, as well as 2 tumors with 6p21 amplifications. Strikingly, this locus overlapped with copy gains in 4 of 371 lung adenocarcinomas. Overexpression of VEGFA via 6p21 gain in hepatocellular carcinomas suggested a novel, non–cell-autonomous mechanism of oncogene activation. Hierarchical clustering of gene expression among 91 of these tumors identified five classes, including “CTNNB1”, “proliferation”, “IFN-related”, a novel class defined by polysomy of chromosome 7, and an unannotated class. These class labels were further supported by molecular data; mutations in CTNNB1 were enriched in the “CTNNB1” class, whereas insulin-like growth factor I receptor and RPS6 phosphorylation were enriched in the “proliferation” class. The enrichment of signaling pathway alterations in gene expression classes provides insights on hepatocellular carcinoma pathogenesis. Furthermore, the prevalence of VEGFA high-level gains in multiple tumor types suggests indications for clinical trials of antiangiogenic therapies. [Cancer Res 2008;68(16):6779–88]

Background & AimsCholangiocarcinoma, the second most common liver cancer, can be classified as intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) or extrahepatic cholangiocarcinoma. We performed an integrative genomic analysis of ICC samples from a large series of patients.MethodsWe performed a gene expression profile, high-density single-nucleotide polymorphism array, and mutation analyses using formalin-fixed ICC samples from 149 patients. Associations with clinicopathologic traits and patient outcomes were examined for 119 cases. Class discovery was based on a non-negative matrix factorization algorithm and significant copy number variations were identified by Genomic Identification of Significant Targets in Cancer (GISTIC) analysis. Gene set enrichment analysis was used to identify signaling pathways activated in specific molecular classes of tumors, and to analyze their genomic overlap with hepatocellular carcinoma (HCC).ResultsWe identified 2 main biological classes of ICC. The inflammation class (38% of ICCs) is characterized by activation of inflammatory signaling pathways, overexpression of cytokines, and STAT3 activation. The proliferation class (62%) is characterized by activation of oncogenic signaling pathways (including RAS, mitogen-activated protein kinase, and MET), DNA amplifications at 11q13.2, deletions at 14q22.1, mutations in KRAS and BRAF, and gene expression signatures previously associated with poor outcomes for patients with HCC. Copy number variation–based clustering was able to refine these molecular groups further. We identified high-level amplifications in 5 regions, including 1p13 (9%) and 11q13.2 (4%), and several focal deletions, such as 9p21.3 (18%) and 14q22.1 (12% in coding regions for the SAV1 tumor suppressor). In a complementary approach, we identified a gene expression signature that was associated with reduced survival times of patients with ICC; this signature was enriched in the proliferation class (P < .001).ConclusionsWe used an integrative genomic analysis to identify 2 classes of ICC. The proliferation class has specific copy number alterations, activation of oncogenic pathways, and is associated with worse outcome. Different classes of ICC, based on molecular features, therefore might require different treatment approaches. Cholangiocarcinoma, the second most common liver cancer, can be classified as intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) or extrahepatic cholangiocarcinoma. We performed an integrative genomic analysis of ICC samples from a large series of patients. We performed a gene expression profile, high-density single-nucleotide polymorphism array, and mutation analyses using formalin-fixed ICC samples from 149 patients. Associations with clinicopathologic traits and patient outcomes were examined for 119 cases. Class discovery was based on a non-negative matrix factorization algorithm and significant copy number variations were identified by Genomic Identification of Significant Targets in Cancer (GISTIC) analysis. Gene set enrichment analysis was used to identify signaling pathways activated in specific molecular classes of tumors, and to analyze their genomic overlap with hepatocellular carcinoma (HCC). We identified 2 main biological classes of ICC. The inflammation class (38% of ICCs) is characterized by activation of inflammatory signaling pathways, overexpression of cytokines, and STAT3 activation. The proliferation class (62%) is characterized by activation of oncogenic signaling pathways (including RAS, mitogen-activated protein kinase, and MET), DNA amplifications at 11q13.2, deletions at 14q22.1, mutations in KRAS and BRAF, and gene expression signatures previously associated with poor outcomes for patients with HCC. Copy number variation–based clustering was able to refine these molecular groups further. We identified high-level amplifications in 5 regions, including 1p13 (9%) and 11q13.2 (4%), and several focal deletions, such as 9p21.3 (18%) and 14q22.1 (12% in coding regions for the SAV1 tumor suppressor). In a complementary approach, we identified a gene expression signature that was associated with reduced survival times of patients with ICC; this signature was enriched in the proliferation class (P < .001). We used an integrative genomic analysis to identify 2 classes of ICC. The proliferation class has specific copy number alterations, activation of oncogenic pathways, and is associated with worse outcome. Different classes of ICC, based on molecular features, therefore might require different treatment approaches.