Abstract Due to its decade‐long progression, colorectal cancer (CRC) is most suitable for population screening to achieve a significant reduction in its incidence and mortality. DNA methylation has emerged as a potential marker for the early detection of CRC. However, the current mainstream methylation detection method represented by bisulfite conversion has issues such as tedious operation, DNA damage, and unsatisfactory sensitivity. Herein, a new high‐performance CRC screening tool based on the promising specific terminal‐mediated polymerase chain reaction (STEM‐PCR) strategy is developed. CRC‐related methylation‐specific candidate CpG sites are first prescreened through The Cancer Genome Atlas (TCGA) and Gene Expression Omnibus (GEO) databases using self‐developed bioinformatics. Next, 9 homebrew colorectal cancer DNA methylated STEM‒PCR assays (ColoC‐mSTEM) with high sensitivity (0.1%) and high specificity are established to identify candidate sites. The clinical diagnostic performance of these selected methylation sites is confirmed and validated by a case‐control study. The optimized diagnostic model has an overall sensitivity of 94.8% and a specificity of 95.0% for detecting early‐stage CRC. Taken together, ColoC‐mSTEM, based on a single methylation‐specific site, is a promising diagnostic approach for the early detection of CRC which is perfectly suitable for the screening needs of CRC in primary healthcare institutions.

Accurate identification and quantification of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) can help elucidate its function in gene expression and disease pathogenesis. Current 5hmC analysis methods still present challenges, especially for clinical applications, such as having a risk of false-positive results and a lack of sufficient sensitivity. Herein, a 5hmC quantification method for fragment-specific DNA sequences with extreme specificity, high sensitivity, and clinical applicability was established using a quantitative real-time PCR (qPCR)-based workflow through the combination of enzymatic digestion and biological deamination strategy (EDD-5hmC assay). The EDD-5hmC approach enriched glycosylated 5hmC via enzyme digestion and then APOBEC (apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like)-mediated deamination to efficiently differentiate between various cytosine(C) modification states, resulting in 5hmC quantification with extreme specificity such that nonspecific amplification is reduced over eight million-fold. Moreover, the nondestructive biological treatment process of the EDD-5hmC assay exhibits high sensitivity, yielding the limit of detection of 30 aM. For the first time, we measured 5hmC levels in colorectal cancer tissues and matched paracancerous tissues to evaluate the ability to differentiate colorectal cancer, with the area under the receiver operating characteristic curve of up to 82.8% for the single gene of Septin9 and 83.6% for the combinations of Septin9 and Syndecan-2 (SDC2), demonstrating the EDD-5hmC assay is a promising method with clinical applicability for accurately quantifying the 5hmC level.