Subcutaneous (SC) rituximab has demonstrated advantages over intravenous (IV) administration; however, insufficient data exist on its use with cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone (R-CHOP) in Chinese patients with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). This multicenter, phase II, randomized, controlled study was conducted across China between February 2021 and October 2022. Fifty adult patients with previously untreated CD20-positive DLBCL were randomized to receive one cycle of IV rituximab and seven cycles of SC rituximab (RSC-CHOP; n = 26), or eight cycles of IV rituximab (RIV-CHOP; n = 24), combined with six or eight cycles of CHOP. Geometric mean ratio of trough rituximab serum concentration of SC to that of IV rituximab (Ctrough,SC/Ctrough,IV) at cycle 7 was 1.52 (90% CI: 1.28–1.79), demonstrating non-inferiority of Ctrough,SC. The complete response rate was similar in both treatment arms. SC rituximab is a viable option in Chinese patients with untreated CD20-positive DLBCL, potentially reducing administration burden (ClinicalTrials.gov identifier: NCT04660799).

Abstract Cancer immunotherapy is a potent anti-cancer therapy which uses a patients own immune system to fight their cancer. Activating the immune system is crucial in successful cancer immunotherapies, various proteins, such as the Fes non-receptor tyrosine kinase exist to limit activation and maintain homeostasis. However, in cancer settings, this serves as a barrier to successful cancer immunotherapy. Here, we demonstrate the role of Fes, abundantly expressed in macrophages, as a novel innate intracellular immune checkpoint. Fes inactivity is associated with delayed tumour onset in a dose-dependent manner, and its deletion delays tumour growth, improves survival, enhances doxorubicin therapy, and sensitizes previously resistant tumours to anti-PD-1 immune checkpoint blockade. These effects are associated with an increase in Toll-like receptor signaling in antigen presenting cells, leading to an increase in proinflammatory cytokine production and T-cell capabilities. Furthermore, we demonstrate a novel role for Fes in regulating the presentation of cytokines on macrophage cell surfaces to enhance T-cell activation. Our results highlight Fes as a novel innate immune checkpoint with potential uses as predictive biomarker to effective immune checkpoint blockade, and a potential therapeutic target for successful anti-cancer immunotherapy.

Abstract Calpains are a family of 15 calcium-activated cysteine proteases that have emerged as potential therapeutic targets in triple negative breast cancer (TNBC). They regulate the function of their substrates via limited proteolytic processing and are involved in both pro- and anti-apoptotic signaling pathways, as well as membrane-cytoskeletal remodeling events associated with cell migration and invasion. The most well-understood members of the calpain family are the classical calpain-1 and calpain-2 isoforms, which are ubiquitously expressed heterodimers each consisting of a large catalytic subunit, encoded by the capn1 and capn2 genes, respectively, and a common small regulatory subunit encoded by capns1. Overexpression of calpain-1 and calpain-2 has been associated with shorter survival in HER2+ breast cancer and TNBC, respectively. We hypothesize that inhibition of calpain-1 and calpain-2 may be exploited to improve tumor response to cytotoxic chemotherapy and suppress metastasis. CRISPR-Cas9 mediated knockout of capns1 in AC2M2 mouse mammary carcinoma cells, which results in a loss of both calpain-1 and calpain-2 activity, disrupts migration and invasion in vitro and impedes lung metastasis in tail vein and orthotopic engraftment mouse models. Calpain knockout also sensitizes AC2M2 cells to the microtubule stabilizing drug paclitaxel, and preliminary results suggest that cancer cell intrinsic calpain depletion may prevent neoadjuvant chemotherapy-induced metastasis. To explore potential off-target effects associated with systemic calpain inhibition, we have established a novel transgenic mouse with conditional deletion of capns1 in its hematopoietic stem cell lineage. By comparing the immune profiles of wild-type and capns1 knockout mice, we aim to better understand how calpain inhibitors will affect various immune cell populations and their respective functions. We plan to extend this understanding to anticancer immunity by conducting tumor immunophenotyping experiments in syngeneic orthotopic engraftment models using wild-type and capns1 knockout mice. At present, no clinically relevant calpain inhibitors are available. However, using genetic approaches, we have validated calpain-1 and calpain-2 as relevant therapeutic targets in TNBC, providing rationale for the development of selective calpain inhibitors. Citation Format: Danielle Harper, Ivan Shapovalov, Samantha Cockburn, Jenny Min, Yan Gao, Peter A. Greer. Genetic disruption of CAPNS1 impedes triple-negative breast cancer metastasis: A case for selective calpain-1/2 inhibitors [abstract]. In: Proceedings of the AACR Special Conference in Cancer Research: Optimizing Therapeutic Efficacy and Tolerability through Cancer Chemistry; 2024 Dec 9-11; Toronto, Ontario, Canada. Philadelphia (PA): AACR; Mol Cancer Ther 2024;23(12_Suppl):Abstract nr A009.

Abstract Immunotherapies are a promising emerging pillar of cancer treatment, but they still face many barriers due to the immunosuppressive nature of cancer. Cancer immunotherapy relies on the interplay between innate and adaptive immune responses. One way of stimulating such responses, known as immunogenic cell death (ICD), involves the release of tumour-associated antigens and damage associated molecular patterns (DAMPs). These DAMPs function to recruit and activate innate immune cells, including antigen-presenting cells (APCs), through engagement of pattern recognition receptors (PRRs), subsequently leading to production of the pro-inflammatory Signal 3 cytokines required for activation of adaptive immune cells (e.g., cytotoxic T lymphocytes [CTLs] and natural killer [NK] cells). The tyrosine kinase Fes suppresses innate immune responses in APCs by inhibiting components of the PRR signaling cascade. In non-cancer contexts, the negative regulation of APCs by Fes may guard against consequences of overactive innate immunity, including endotoxic shock or autoimmune disease. However, this same inhibitory effect on APC function may also serve as a checkpoint to successful anti-cancer immunotherapy, by obstructing efficient priming of cancer specific CTLs by APCs. Therefore, by inhibiting Fes, we hypothesize there will be greater Signal 3 cytokine production, resulting in greater CTL activation, and therefore improved tumor control. Using bone marrow derived APCs, including macrophages (BMDMs) and dendritic cells (BMDCs), from wildtype (WT) or Fes knockout (fes-/-) mice, we have shown through both Western blotting and flow cytometry analysis, that PRR signal transduction cascades are suppressed by Fes and increase levels of Signal 3 cytokines produced by fes-/- APCs. This includes higher levels of cell associated IL-12 in fes-/- APCs. Using syngeneic orthotopic mouse engraftment models of triple negative breast cancer (EO771) and melanoma (B16-F10) we showed that treatment with doxorubicin (which induces ICD) or anti-PD-1 (immune checkpoint inhibitor) plus doxorubicin controls tumor growth and prolongs survival to a greater extent in fes-/- mice. Immunophenotyping of tumors and spleens from these mice showed higher levels of activated CTLs and skewing of macrophages to a M1 state in fes-/- mice. SIINFEKL peptide loaded-BMDM/BMDCs from fes-/- mice were also more effective at priming CTLs from OT-1 mice (which express a T cell receptor that recognizes the SIINFEKL peptide) in antigen cross-presentation co-culture assays. These results implicate Fes as a potential novel immune checkpoint whose inhibition may enhance anti-cancer immunotherapy by suppressing its role in dampening inflammatory Signal 3 cytokine production by APCs. I will present recent data exploring the role of Fes in regulating the expression and trafficking of IL-12 in APCs to better understand the molecular basis of improved CTL activation by fes-/- APCs. Citation Format: Julian Simonetti, Brian J. Laight, Natasha Dmytryk, Danielle Harper, Yan Gao, Changnian Shi, Madhuri Koti, Sameh Basta, Peter A. Greer. The FES tyrosine kinase as an emerging target for cancer immunotherapy [abstract]. In: Proceedings of the AACR Special Conference in Cancer Research: Optimizing Therapeutic Efficacy and Tolerability through Cancer Chemistry; 2024 Dec 9-11; Toronto, Ontario, Canada. Philadelphia (PA): AACR; Mol Cancer Ther 2024;23(12_Suppl):Abstract nr A017.

Abstract Introduction The prognosis of relapsed or refractory mature T‐ and natural killer (NK)‐cell lymphoma remains dismal. Novel agents are urgently needed to improve the outcomes for this population. Methods In this phase 2, multicenter, open‐label, single‐arm study (NCT03776279), the authors report the efficacy and safety of liposomal mitoxantrone (Lipo‐MIT) monotherapy in patients with relapsed or refractory mature T‐ and NK‐cell lymphoma. Lipo‐MIT was administered intravenously at 20 mg/m 2 once every 4 weeks. The primary end points were the objective response rate (ORR) determined by the independent review committee (IRC) and investigators. Secondary end points included duration of response (DoR), progression‐free survival (PFS), overall survival (OS), and safety. Results From April 26, 2018, to August 10, 2022, 108 eligible patients were enrolled and treated at 26 study centers in China. The ORRs were 41.7% (95% confidence interval [CI], 32.3–51.5%) per IRC and 46.3% (95% CI, 36.7%–56.2%) per investigators; 25 (23.1%) and 15 (13.9%) patients, respectively, achieved complete response. With a median follow‐up of 29.5 months, median PFS per IRC was 8.5 months (95% CI, 6.0–11.9); median OS was 23.3 months (95% CI, 12.0–not evaluable); median DoR per IRC was not reached. The most frequent treatment‐emergent adverse events were decreased white blood cell count (75, 69.4%), decreased neutrophil count (73, 67.6%), and decreased platelet count (47, 43.5%). Conclusions Lipo‐MIT monotherapy showed robust and durable antitumor activity with a manageable safety profile, representing a new therapeutic option in relapsed or refractory mature T‐ and NK‐cell lymphoma.

Abstract Calpain-1 and calpain-2 are heterodimeric calcium-dependent cysteine proteases composed of the catalytic subunits CAPN1 or CAPN2, respectively, and the common regulatory subunit CAPNS1. They are associated with cancer progression, metastasis, and treatment resistance in breast cancer. Here, we present novel insights into the therapeutic potential of calpain inhibition by combining genetic disruption and preclinical mouse tumor models and biosensor-based detection of calpain heterodimerization with ongoing efforts to discover small-molecule and peptide inhibitors. CRISPR-Cas9-mediated knockout of CAPN1, CAPN2, or CAPNS1 in MDA-MB-231 human triple-negative breast cancer (TNBC) cells revealed that disruption of both calpains, through CAPNS1 knockout, significantly reduced cell migration and inhibited spontaneous metastasis in a mouse orthotopic engraftment model by over 80%. Individual knockouts of CAPN1 or CAPN2 also reduced metastasis but to a lesser extent, highlighting the necessity of dual inhibition for optimal therapeutic effect. In parallel, we have been actively seeking small molecules and peptide inhibitors to target calpain through two approaches: inhibiting the PEF-PEF interaction that mediates heterodimerization using small molecules; and targeting the active site using a calpastatin (CAST)-based peptide. To identify small molecules capable of disrupting the PEF-PEF interaction, we conducted in silico screens of over 3.6 million compounds from several libraries. These compounds were evaluated based on their calculated binding affinity and potential to sterically hinder the conformational changes required for calpain activity. The CAST-based peptide inhibitor was designed based on the active site binding B-domain and tested on a purified calpain-2. These efforts lay the groundwork for novel therapeutic approaches targeting calpain-1 and calpain-2, which have emerged as promising targets for preventing metastasis in TNBC. We will present our progress in identifying and validating these small molecules and peptides for further development. Citation Format: Ivan Shapovalov, Pitambar Poudel, Shailesh K. Panday, Danielle Harper, Jung Yeon Min, Yan Gao, Kazem Nouri, Emil Alexov, Peter A. Greer. Targeting calpain-1 and calpain-2 for prevention of breast cancer metastasis: In vivo insights and drug discovery approaches. [abstract]. In: Proceedings of the AACR Special Conference in Cancer Research: Optimizing Therapeutic Efficacy and Tolerability through Cancer Chemistry; 2024 Dec 9-11; Toronto, Ontario, Canada. Philadelphia (PA): AACR; Mol Cancer Ther 2024;23(12_Suppl):Abstract nr A016