Precision oncology requires the timely selection of effective drugs for individual patients. An ideal platform would enable rapid screening of cell type-specific drug sensitivities directly in patient tumor tissue and reveal strategies to overcome intratumoral heterogeneity. Here we combine multiplexed drug perturbation in acute slice culture from freshly resected tumors with single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) to profile transcriptome-wide drug responses. We applied this approach to glioblastoma (GBM) and demonstrated that acute slice cultures from individual patients recapitulate the cellular and molecular features of the originating tumor tissue. Detailed investigation of etoposide, a topoisomerase poison, and the histone deacetylase (HDAC) inhibitor panobinostat in acute slice cultures revealed cell type-specific responses across multiple patients, including unexpected effects on the immune microenvironment. We anticipate that this approach will facilitate rapid, personalized drug screening to identify effective therapies for solid tumors.

Abstract While efforts to identify microglial subtypes have recently accelerated, the relation of transcriptomically defined states to function has been largely limited to in silico annotations. Here, we characterize a set of pharmacological compounds that have been proposed to polarize human microglia towards two distinct states – one enriched for AD and MS genes and another characterized by increased expression of antigen presentation genes. Using different model systems including HMC3 cells, iPSC-derived microglia and cerebral organoids, we characterize the effect of these compounds in mimicking human microglial subtypes in vitro . We show that the Topoisomerase I inhibitor Camptothecin induces a CD74 high /MHC high microglial subtype which is specialized in amyloid beta phagocytosis. Camptothecin suppressed amyloid toxicity and restored microglia back to their homeostatic state in a zebrafish amyloid model. Our work provides avenues to recapitulate human microglial subtypes in vitro , enabling functional characterization and providing a foundation for modulating human microglia in vivo .

SUMMARY Glioma cells hijack developmental transcriptional programs to control cell state. During neural development, lineage trajectories rely on specialized metabolic pathways. However, the link between tumor cell state and metabolic programs is poorly understood in glioma. Here we uncover a glioma cell state-specific metabolic liability that can be leveraged therapeutically. To model cell state diversity, we generated genetically engineered murine gliomas, induced by deletion of p53 alone (p53) or with constitutively active Notch signaling (N1IC), a pathway critical in controlling cellular fate. N1IC tumors harbored quiescent astrocyte-like transformed cell states while p53 tumors were predominantly comprised of proliferating progenitor-like cell states. N1IC cells exhibit distinct metabolic alterations, with mitochondrial uncoupling and increased ROS production rendering them more sensitive to inhibition of the lipid hydroperoxidase GPX4 and induction of ferroptosis. Importantly, treating patient-derived organotypic slices with a GPX4 inhibitor induced selective depletion of quiescent astrocyte-like glioma cell populations with similar metabolic profiles.

Glioblastoma (GBM) is a deadly brain tumor, and the kinesin motor KIF11 is an attractive therapeutic target because of its dual roles in proliferation and invasion. The clinical utility of KIF11 inhibitors has been limited by drug resistance, which has mainly been studied in animal models. We used multiplexed lineage tracing barcodes and scRNA-seq to analyze drug resistance time courses for patient-derived GBM neurospheres treated with ispinesib, a potent KIF11 inhibitor. Similar to GBM progression in patients, untreated cells lost their neural lineage identity and transitioned to a mesenchymal phenotype, which is associated with poor prognosis. In contrast, cells subjected to long-term ispinesib treatment exhibited a proneural phenotype. We generated patient-derived xenografts to show that ispinesib-resistant cells form less aggressive tumors in vivo, even in the absence of drug. Finally, we used lineage barcodes to nominate drug combination targets by retrospective analysis of ispinesib-resistant clones in the drug-naïve setting and identified drugs that are synergistic with ispinesib.

Single-cell transcriptomic analyses now frequently involve elaborate study designs including samples from multiple individuals, experimental conditions, perturbations, and batches from complex tissues. Dimensionality reduction is required to facilitate integration, interpretation, and statistical analysis. However, these datasets often include subtly different cellular subpopulations or state transitions, which are poorly described by clustering. We previously reported a Bayesian matrix factorization algorithm called single-cell hierarchical Poisson factorization (scHPF) that identifies gene co-expression patterns directly from single-cell RNA-seq (scRNA-seq) count matrices while accounting for transcript drop-out and noise. Here, we describe consensus scHPF, which analyzes scHPF models from multiple random initializations to identify the most robust gene signatures and automatically determine the number of factors for a given dataset. Consensus scHPF facilitates integration of complex datasets with highly multi-modal posterior distributions, resulting in factors that can be uniformly analyzed across individuals and conditions. To demonstrate the utility of consensus scHPF, we performed a meta-analysis of a large-scale scRNA-seq dataset from drug-treated, human glioma slice cultures generated from surgical specimens across three major cell types, 19 patients, 10 drug treatment conditions, and 52 samples. In addition to recapitulating previously reported cell type-specific drug responses from smaller studies, consensus scHPF identified disparate effects of the topoisomerase poisons etoposide and topotecan that are highly consistent with the distinct roles and expression patterns of their respective protein targets.

Abstract Dexamethasone is the most widely utilized drug for glioblastoma (GBM). However, systemic delivery of dexamethasone in GBM patients is associated with significant side effects and increasing doses with worse survival. Convection-enhanced delivery (CED) can deliver high doses of immunotherapy directly into the tumor microenvironment (TME) while avoiding systemic toxicity. Here, we report that high doses of dexamethasone can be delivered locally by CED without side effects and increase survival in a GBM model along with reduced inflammatory myeloid signatures. We investigated CED of dexamethasone treatment on survival(n=40), adverse side effects, and the immunological TME through peripheral analyses, liquid chromatography–mass spectrometry, and histology in a preclinical syngeneic mouse model. Additionally, we assessed the transcriptional responses of human GBM slices and stem-cell-derived human microglia after steroid treatment through bulk and single-cell RNA sequencing. We found that 7-day treatment with CED of dexamethasone produced a significant survival advantage in glioma-bearing mice compared to non-treated control(p=0.03). Systemic dexamethasone achieved low levels of drug in the TME and caused dysregulated blood glucose, blood counts, and peripheral organ weights, while high CED doses avoided these side effects(p< 0.05 each). Steroid treatment of acute GBM slices and lipopolysaccharide-activated microglia in-vitro both reversed inflammatory myeloid signatures associated with poor survival and recurrence on RNA sequencing analyses. We demonstrate the preclinical efficacy of delivering high local doses of dexamethasone in a GBM model through CED and observed prolonged survival along with reduced adverse inflammatory myeloid signatures. No side effects were demonstrated after chronic CED treatment of dexamethasone while systemic delivery achieved poor tumor penetration and caused known hematologic and metabolic side effects supporting the potential to optimize the clinical use of this therapy. CED of dexamethasone provides us a new treatment paradigm to locally control inflammatory signatures in the glioma TME in a controlled fashion.

Glioblastoma heterogeneity and plasticity remain controversial, with proposed subtypes representing the average of highly heterogeneous admixtures of independent transcriptional states. Single-cell, protein-activity-based analysis allowed full quantification of >6,000 regulatory and signaling proteins, thus providing a previously unattainable single-cell characterization level. This helped identify four novel, molecularly distinct subtypes that successfully harmonize across multiple GBM datasets, including previously published bulk and single-cell profiles and single cell profiles from seven orthotopic PDX models, representative of prior subtype diversity. GBM is thus characterized by the plastic coexistence of single cells in two mutually-exclusive developmental lineages, with additional stratification provided by their proliferative potential. Consistently, all previous subtypes could be recapitulated by single-cell mixtures drawn from newly identified states. Critically, drug sensitivity was predicted and validated as highly state- dependent, both in single-cell assays from patient-derived explants and in PDX models, suggesting that successful treatment requires combinations of multiple drugs targeting these distinct tumor states.