ExFISH extends expansion microscopy to single-molecule RNA imaging, enabling super-resolution imaging of diverse RNAs in cells and tissues on conventional microscopes. The method enables multiplexed imaging of RNA and improved RNA quantitation. The ability to image RNA identity and location with nanoscale precision in intact tissues is of great interest for defining cell types and states in normal and pathological biological settings. Here, we present a strategy for expansion microscopy of RNA. We developed a small-molecule linker that enables RNA to be covalently attached to a swellable polyelectrolyte gel synthesized throughout a biological specimen. Then, postexpansion, fluorescent in situ hybridization (FISH) imaging of RNA can be performed with high yield and specificity as well as single-molecule precision in both cultured cells and intact brain tissue. Expansion FISH (ExFISH) separates RNAs and supports amplification of single-molecule signals (i.e., via hybridization chain reaction) as well as multiplexed RNA FISH readout. ExFISH thus enables super-resolution imaging of RNA structure and location with diffraction-limited microscopes in thick specimens, such as intact brain tissue and other tissues of importance to biology and medicine.

Identifying transcript location in cells Identifying where specific RNAs occur within a cell or tissue has been limited by technology and imaging capabilities. Expansion microscopy has allowed for better visualization of small structures by expanding the tissues with a polymer- and hydrogel-based system. Alon et al. combined expansion microscopy with long-read in situ RNA sequencing, resulting in a more precise visualization of the location of specific transcripts. This method, termed “ExSeq” for expansion sequencing, was used to detect RNAs, both new transcripts and those previously demonstrated to localize to neuronal dendrites. Unlike other in situ sequencing methods, ExSeq does not target sets of genes. This technology thus unites spatial resolution, multiplexing, and an unbiased approach to reveal insights into RNA localization and its physiological roles in developing and active tissue. Science , this issue p. eaax2656

Accurate measurement of clonal genotypes, mutational processes, and replication states from individual tumor-cell genomes will facilitate improved understanding of tumor evolution. We have developed DLP+, a scalable single-cell whole-genome sequencing platform implemented using commodity instruments, image-based object recognition, and open source computational methods. Using DLP+, we have generated a resource of 51,926 single-cell genomes and matched cell images from diverse cell types including cell lines, xenografts, and diagnostic samples with limited material. From this resource we have defined variation in mitotic mis-segregation rates across tissue types and genotypes. Analysis of matched genomic and image measurements revealed correlations between cellular morphology and genome ploidy states. Aggregation of cells sharing copy number profiles allowed for calculation of single-nucleotide resolution clonal genotypes and inference of clonal phylogenies and avoided the limitations of bulk deconvolution. Finally, joint analysis over the above features defined clone-specific chromosomal aneuploidy in polyclonal populations.

Abstract: Methods for highly multiplexed RNA imaging are limited in spatial resolution, and thus in their ability to localize transcripts to nanoscale and subcellular compartments. We adapt expansion microscopy, which physically expands biological specimens, for long-read untargeted and targeted in situ RNA sequencing. We applied untargeted expansion sequencing (ExSeq) to mouse brain, yielding readout of thousands of genes, including splice variants and novel transcripts. Targeted ExSeq yielded nanoscale-resolution maps of RNAs throughout dendrites and spines in neurons of the mouse hippocampus, revealing patterns across multiple cell types; layer-specific cell types across mouse visual cortex; and the organization and position-dependent states of tumor and immune cells in a human metastatic breast cancer biopsy. Thus ExSeq enables highly multiplexed mapping of RNAs, from nanoscale to system scale. One Sentence Summary In situ sequencing of physically expanded specimens enables multiplexed mapping of RNAs at nanoscale, subcellular resolution.

Abstract Mapping and molecularly annotating mammalian neural circuits is challenging due to the inability to uniquely label cells while also resolving subcellular features such as synaptic proteins or fine cellular processes. We argue that an ideal technology for connectomics would have the following characteristics: the capacity for robust distance-independent labeling, synaptic resolution, molecular interrogation, and scalable computational methods . The recent development of high-diversity cellular barcoding with RNA has provided a way to overcome the labeling limitations associated with spectral dyes, however performing all-optical circuit mapping has not been demonstrated because no method exists to image barcodes throughout cells at synaptic-resolution. Here we show ExBarSeq, an integrated method combining in situ sequencing of RNA barcodes, immunostaining, and Expansion Microscopy coupled with an end-to-end software pipeline that automatically extracts barcode identities from large imaging datasets without data processing bottlenecks. As a proof of concept, we applied ExBarSeq to thick tissue sections from mice virally infected with MAPseq viral vectors and demonstrated the extraction of 50 barcoded cells in the visual cortex as well as cell morphologies uncovered via immunostaining. The current work demonstrates high resolution multiplexing of exogenous barcodes and endogenous synaptic proteins and outlines a roadmap for molecularly annotated connectomics at a brain-wide scale.

We present Barcoded Oligonucleotides Ligated On RNA Amplified for Multiplexed and parallel In-Situ analysis (BOLORAMIS), a reverse-transcription (RT)-free method for spatially-resolved, targeted, in-situ RNA identification of single or multiple targets. For this proof of concept, we have profiled 154 distinct coding and small non-coding transcripts ranging in sizes 18 nucleotide (nt) in length and upwards, from over 200,000 individual human induced pluripotent stem cells (iPSC) and demonstrated compatibility with multiplexed detection, enabled by fluorescent in-situ sequencing. We use BOLORAMIS data to identify differences in spatial localization and cell-to-cell expression heterogeneity. Our results demonstrate BOLORAMIS to be a generalizable toolset for targeted, in-situ detection of coding and small non-coding RNA for single or multiplexed applications.