We have developed a new assay, ISET (isolation by size of epithelial tumor cells), which allows the counting and the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells in patients with carcinoma, using peripheral blood sample volumes as small as 1 ml. Using this assay, epithelial tumor cells can be isolated individually by filtration because of their larger size when compared to peripheral blood leukocytes. ISET parameters were defined using peripheral blood spiked with tumor cell lines (HepG2, Hep3B, MCF-7, HeLa, and LNCaP). ISET can detect a single, micropipetted tumor cell, added to 1 ml of blood. We also demonstrate that fluorescence in situ hybridization can be used to perform chromosomal analyses on tumor cells collected using ISET. Polymerase chain reaction-based genetic analyses can be applied to ISET-isolated cells, and, as an example, we demonstrate homozygous p53 deletion in single Hep3B cells after filtration and laser microdissection. Finally, we provide evidence for the in vivo feasibility of ISET in patients with hepatocellular carcinoma undergoing tumor resection. ISET, but not reverse transcriptase-polymerase chain reaction, allowed analysis of cell morphology, counting of tumor cells, and demonstration of tumor microemboli spread into peripheral blood during surgery. Overall, ISET constitutes a novel approach that should open new perpectives in molecular medicine. We have developed a new assay, ISET (isolation by size of epithelial tumor cells), which allows the counting and the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells in patients with carcinoma, using peripheral blood sample volumes as small as 1 ml. Using this assay, epithelial tumor cells can be isolated individually by filtration because of their larger size when compared to peripheral blood leukocytes. ISET parameters were defined using peripheral blood spiked with tumor cell lines (HepG2, Hep3B, MCF-7, HeLa, and LNCaP). ISET can detect a single, micropipetted tumor cell, added to 1 ml of blood. We also demonstrate that fluorescence in situ hybridization can be used to perform chromosomal analyses on tumor cells collected using ISET. Polymerase chain reaction-based genetic analyses can be applied to ISET-isolated cells, and, as an example, we demonstrate homozygous p53 deletion in single Hep3B cells after filtration and laser microdissection. Finally, we provide evidence for the in vivo feasibility of ISET in patients with hepatocellular carcinoma undergoing tumor resection. ISET, but not reverse transcriptase-polymerase chain reaction, allowed analysis of cell morphology, counting of tumor cells, and demonstration of tumor microemboli spread into peripheral blood during surgery. Overall, ISET constitutes a novel approach that should open new perpectives in molecular medicine. Although cancer is being diagnosed at increasingly earlier stages, most patients continue to succumb to metastatic disease,1Kohn E Liotta L Molecular insights into cancer invasion: strategies for prevention and intervention.Cancer Res. 1995; 55: 1856-1862PubMed Google Scholar and suitable assays that efficiently recognize invasive tumor cells appearing in the peripheral blood circulation are lacking so far. In this context, animal studies demonstrating circulating tumorous cells (CTCs) spread from solid tumors2Liotta L Kleinerman J Saidel G Quantitative relationship of intravascular tumor cells, tumor vessels and pulmonary metastasis following tumor implantation.Cancer Res. 1974; 34: 997-1004PubMed Google Scholar have been followed by similar efforts in humans, the major obstacle being, at least in patients without clinical signs of metastasis, their extremely low number,3Pelkey T Frierson HJ Bruns D Molecular and immunological detection of circulating tumor cells and micrometastases from solid tumors.Clin Chem. 1996; 42: 1369-1381PubMed Google Scholar in the range of one per milliliter. Because of their high sensitivity, reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)-based assays have been applied to this problem over the past few years.3Pelkey T Frierson HJ Bruns D Molecular and immunological detection of circulating tumor cells and micrometastases from solid tumors.Clin Chem. 1996; 42: 1369-1381PubMed Google Scholar However, cell integrity is destroyed during RNA extraction, thus preventing the analysis of cell morphology and phenotype. Moreover, RT-PCR tests are unsuitable, in most instances, for distinguishing between circulating nontumorous and tumorous cells.4Louha M Nicolet J Zylberberg H Sabile A Vons C Vona G Poussin K Tournebize M Capron F Pol S Franco D Lacour B Bréchot C Paterlini-Bréchot P Liver resection and needle liver biopsy cause hematogenous dissemination of liver cells.Hepatology. 1999; 29: 879-882Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 5Cama C Olsson C Buttyan R De Vries G Wise G Katz A Molecular staging of prostate cancer. III. Effects of cystoscopy and needle biopsy on the enhanced reverse transcriptase chain reaction assay.J Urol. 1997; 157: 1748-1751Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (13) Google Scholar These assays detect tissue-specific mRNAs in peripheral blood, and thus their specificity for tumor cells depends entirely on the assumption that normal tissue cells do not circulate, unless they become tumorous. We describe here a new technology, ISET (isolation by size of epithelial tumor cells), which provides a morphological, immunocytological, and genetic characterization of individual CTCs. The test allows the collection of carcinoma cells by filtration, because of their larger size when compared to peripheral blood leukocytes. We demonstrate that tumor cell karyotype analysis can easily be performed with fluorescence in situ hybridization (FISH). Furthermore, selected individual cells can be recovered by laser microdissection, and their DNA amplified and screened for genetic abnormalities in target sequences. Additional advantages of this technique are its high sensitivity and its suitability for application to a broad range of carcinomas. We validated this experimental approach in patients with hepatocellular carcinoma undergoing tumor resection and showed that ISET, but not α-fetoprotein (AFP) nested PCR, allowed the identification and counting of tumor liver cells that had been disseminated during surgery. Seven patients with hepatocellular carcinoma undergoing surgical liver resection were included in this study. Peripheral blood samples (15 ml) were obtained, on EDTA buffer, before intervention and during surgery and processed up to 5 hours after collection. Nine milliliters of blood was used for RT-PCR, and 6 ml for ISET. Eight healthy volunteers and eight patients with chronic hepatitis were included as controls. Informed consent was obtained from all patients and volunteers participating in this study. Investigations were performed after approval of the local ethical committee. HepG2 (HB 8065; American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) and Hep3B (ATCC, HB 8064) cells (derived from human hepatocellular carcinomas), MCF-7 (ATCC, HTB-22, derived from human breast adenocarcinoma), HeLa (ATCC, CCL-2, derived from a human cervix epithelioid carcinoma), and LNCaP cells (ATCC, CRL 1740, derived from a human metastatic prostatic adenocarcinoma) were cultured as previously described.6Sabile A Louha M Bonte E Poussin K Vona G Mejean A Chretien Y Bougas L Lacour B Capron F Roseto A Bréchot C Paterlini-Bréchot P Efficiency of Ber-EP4 antibody in isolating circulating epithelial tumor cells before RT-PCR detection.Am J Clin Pathol. 1999; 112: 171-178PubMed Google Scholar Morphometric analysis of May-Grumwald-Giemsa-stained HepG2, Hep3B, MCF-7, HeLa, and LNCaP cells and peripheral blood leukocytes (PBLs) was performed with a transmission microscope and Visiolab 200 and Visiolab 1000 softwares. At least 200 cells were analyzed for each cell type. The morphometric instrument was carefully calibrated before each measurement. Only nonclustered isolated cells were analyzed to record the whole cell area, cytoplasm and nucleus areas, and the mean tumor cell/leukocyte area ratio. ISET was carried out using a previously described7Rostagno P Moll J Bisconte J Caldani C Detection of rare circulating breast cancer cells by filtration cytometry and identification by DNA content: sensitivity in an experimental model.Anticancer Res. 1997; 17: 2481-2485PubMed Google Scholar, 8Truchaud A Caldani C Bisconte J Bergogne-Berezin E Buisson D Filtration cytometry: parallel real-time analysis for bacteria, cells, and particles.Clin Chem. 1992; 38: 1650-1651Google Scholar module of filtration (licenses EP513139, US5606351, JO5504405) kindly provided by the Biocom company (Les Ulis, France) and a polycarbonate Track-Etch-type membrane (Cyclotron Technology) with calibrated, 8-μm-diameter, cylindrical pores. The module of filtration has 12 wells, making it possible to load and filter 12 individual samples in parallel. Each sample is filtered through a 0.6-cm-diameter surface area in the membrane. Peripheral blood (6 ml) from patients with carcinoma or from healthy volunteers was collected on buffered EDTA, diluted 1:10 with the filtration buffer containing 0.175% saponin, 0.2% paraformaldehyde, 0.0372% EDTA, and 0.1% bovine serum albumin, left for 10 minutes at room temperature, and filtered. Ten milliters of diluted solution, corresponding to 1 ml of undiluted blood, was loaded on each well and filtered by gentle aspiration under vacuum (created by a vacuum pump). The membrane was then washed once by aspiration with phosphate-buffered saline (PBS), disassembled from the filtration module, and allowed to air-dry. One or more spots, each one corresponding to 1 ml of filtered blood, were then stained with hematoxylin and eosin (H&E) or May-Grumwald-Giemsa, washed once with PBS, and dried. For microscopic studies, the membrane was placed on a specifically designed stage8Truchaud A Caldani C Bisconte J Bergogne-Berezin E Buisson D Filtration cytometry: parallel real-time analysis for bacteria, cells, and particles.Clin Chem. 1992; 38: 1650-1651Google Scholar without aspiration. Sensitivity tests were performed in parallel by ISET and RT-PCR. One and three cultured HepG2, LNCaP, and MCF-7 cells, in fivefold replicates, were individually collected under a microscope equipped with a magnifying glass and mixed to 1 ml of peripheral blood. These 1-ml samples were then analyzed by ISET or by RT-PCR. ISET was carried out by counting tumor cells after KL1 immunostaining. RT-PCR analyses were performed with AFP (α-fetoprotein)-specific primers for HepG2 cells and PSA (prostate specific antigen)-specific primers for LNCaP cells (see below) (Table 1). Individually collected MCF-7 cells were tested using ISET only.Table 1Primers Used for RT-PCR and PCR AssaysPrimersSequencePositionSize PCR productp53P53 F2.25′-GCCATTCTTTTCCTGCTCCA-3′Exon 2302P53 RS25′-TTCGCTTCCCACAGGTCTCT-3′P53 F3.15′-CCCAGCCCCCTAGCAGAGAC-3′Exon 398P53 R35′-GGTCCCAGCCCAACCCTTGT-3′P53 4.15′-CTGGTCCTCTGACTGCTCTT-3′Exon 4338P53 RS45′-AGGCATTGAAGTCTCATGGA-3′P53 F55′-TGTTTGTTTCTTTGCTGCCGTGT-3′Exon 5238P53 R55′-CCCTGTCGTCTCTCCAGCCC-3′P53 F6.15′-TCCGCGCCATGGCCATCTAC-3′Exon 6311P53 R65′-AACCACCCTTAACCCCTCCT-3′P53 F75′-CTCATCTTGGGCCTGTGTT-3′Exon 7185P53 RS75′-GGGTCAGCGGCAAGCAGAG-3′P53 F85′-CTGCCTCTTGCTTCTCTTTT-3′Exon 8235P53 RS85′-GAGGCAAGGAAAGGTGATAA-3′P53 F95′-GGAGGAGACCAAGGGTGCAGTT-3′Exon 9215P53 R9.15′-ATGCCCCAATTGCAGGTAAAACA-3′P53 F105′-GCGACGAGAGTGAGACCCCATC-3′Exon 10322P53 R10.15′-AGGGGAGTAGGGCCAGTAAG-3′P53 FS115′-CAGGGAAAAGGGGCACAGAC-3′Exon 11323P53 R115′-CCTCCTCCCCACAACAAAACACC-3′HLAHLA GH26 (F)5′-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3′Exon 4250HLA GH27 (R)5′-CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTT-3′α-FetoproteinAFP out 1 (F)5′-CTCTTCCAGAAACTAGGAGAA-3′Exon 11537AFP out 2 (R)5′-CTCTTCAGCAAAGCAGACTT-3′Exon 13AFP in 3 (F)5′-GCTGACATTATTATCGGACAC-3′Exon 12282AFP in 4 (R)5′-AGCCTCAAGTTGTTCCTCTGT-3′Exon 13Prostate-specific antigenPSA Ex5′-GAACCAGAGGAGTGTCTTGCCCCAAAA-3′Exon 3–4421PSA 75′-CACAGACACCCCATCCTATC-3′3′NTRPDC25′-TGGACCTCACACCTAAGGACAAAG-3′3′NTR343PSA 85′-TGCGCAAGTTCACCCTCA-3′Exon 4 Open table in a new tab Peripheral blood (6 ml) was collected from patients in buffered EDTA. Nucleated cells were isolated by Ficoll (Ficoll Paque Plus. Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) in preadapted tubes (Leucosep, Bernas, Paris) and resuspended in TRIzol B (Life Technologies). RNA was extracted and resuspended in 6 μl of diethylpyrocarbonate-treated water (1 μl of DEPC-treated water per milliliter of processed blood). RNA solution (6 μl) was reverse-transcribed in a final volume of 20 μl. Ten microliters of cDNA, corresponding to 3 ml of peripheral blood samples, was amplified with a nested protocol using liver-specific (AFP) and prostate-specific (PSA) primers, as already reported.4Louha M Nicolet J Zylberberg H Sabile A Vons C Vona G Poussin K Tournebize M Capron F Pol S Franco D Lacour B Bréchot C Paterlini-Bréchot P Liver resection and needle liver biopsy cause hematogenous dissemination of liver cells.Hepatology. 1999; 29: 879-882Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 6Sabile A Louha M Bonte E Poussin K Vona G Mejean A Chretien Y Bougas L Lacour B Capron F Roseto A Bréchot C Paterlini-Bréchot P Efficiency of Ber-EP4 antibody in isolating circulating epithelial tumor cells before RT-PCR detection.Am J Clin Pathol. 1999; 112: 171-178PubMed Google Scholar For sensitivity tests, the whole RNA extracted from 1 ml of blood spiked with tumor cells was reverse transcribed and then amplified as described. To stain the cells, after rehydration with PBS, hematoxylin was applied to the membrane for 2 minutes, followed by 1% eosin for 3 minutes. The cells were permeabilized with 0.2% Triton for 10 minutes before immunostaining. Primary antibodies diluted 1:100 in 10% fetal calf serum were then applied to the spot for 1 hour at room temperature. These were KL1 (Cytokeratin gp 56 kd; Immunotech S. A., Marseille, France), a cytokeratin, broad spectrum monoclonal antibody; anti-AFP antibody from rabbit (Dako, Glostrup, Denmark). anti-albumin from rabbit (Dako); rabbit anti-glutamine synthetase9Christa L Simon M Flinois J Gebhardt R Bréchot C Lasserre C Overexpression of glutamine synthetase in human primary liver cancer.Gastroenterology. 1994; 106: 1312-1320Abstract PubMed Google Scholar; monoclonal anti-LCA antibody (Dako) reactive to lymphomonocytic cells; and goat anti-MMP3 (or stromelysin 1, which reacts with an enzyme catalyzing degradation of collagen types IV, IX, and XI and proteoglycans, fibronectin and laminin) (Binding Site, Birmingham, UK). The spots were then treated with a biotinylated mixture of anti-mouse and anti-rabbit secondary antibodies for 30 minutes (peroxidase/DAB ChemMate Detection Kit; Dako), followed by a complex, streptavidin-peroxidase, for 30 minutes and DAB (diaminobenzidine) for 15 minutes. For anti-MMP3, a universal biotinylated secondary antibody (Binding Site) was used. Cell nuclei were counterstained with Mayer's hematoxylin (Dako). For double staining, we applied anti-AFP or KL1 antibodies, revealed with a peroxidase/DAB ChemMate Detection Kit (Dako) followed by LCA antibody, and an alkaline phosphatase ChemMate Detection Kit (Dako). For immunofluorescence, fluorescein-conjugated anti-mouse or anti-rabbit secondary antibodies (Amersham, Les Ulis, France) were applied for 45 minutes at room temperature, and the nuclei were counterstained with 7-aminoactinomycin D (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) for 5 minutes at room temperature. Laser microdissection of epithelial tumor cells was performed on H&E-stained filters. Single spots were cut from the membrane and mounted with nail polish on a 0.17-mm-thick slide. Slides were then placed on a robot-stage microscope equipped with a 337-nm pulsed laser microbeam (P.A.L.M., Munich, Germany). Individual cells were dissected with the laser microbeam and then catapulted with a single laser shot into the lid of a microfuge tube suitable for PCR.10Becker I Becker K Rohrl M Minkus G Schutze K Hofler H Single-cell mutation analysis of tumors from stained histologic slides.Lab Invest. 1996; 75: 801-807PubMed Google Scholar The collected cell was then recovered in 15 μl of lysis buffer (100 mmol/L Tris-HCl (pH 8) and 400 μg/ml proteinase K) and spun down by centrifugation. After lysis at 37°C for 16 hours, proteinase K was inactivated at 90°C for 10 minutes and DNA was amplified using the PEP (primer-extension preamplification) protocol.11Zhang L Cui X Schmitt K Hubert R W N Arnheim N Whole genomic amplification from a single cell: implications for genetic analysis.Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 89: 5847-5851Crossref PubMed Scopus (800) Google Scholar Five out of 60 μl of the extension product was coamplified in a final volume of 100 μl containing 10 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, 2 mmol/L MgCl2, 0.01% gelatin, 250 mmol/L of each of four deoxynucleotides, 10 pmol of each HLA and p53-specific primer, and 2.5 U of Taq polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA) for 40 cycles. PCR products were then analyzed by electrophoresis in a 2% agarose gel. For p53 gene mapping, 50 ng of DNA extracted from Hep3B or HepG2 cells was coamplified with HLA and p53 primers. Ten p53-specific primer sets were used to amplify p53 exons (Table 1). The membranes were pretreated with Triton 0.1% in PBS buffer at room temperature for 10 minutes, followed by proteinase K (0.1 μg/ml. digestion at 37°C for 8 minutes. Interphase nuclei were denatured in 70% formamide/2SSC (sodium saline citrate) at 72°C for 2 minutes and then dehydrated through an ethanol series (70, 80, 90, 100%). Hybridization and signal revelation of a chromosome 1 centromeric biotinylated (Oncor, Gaithersburg, MD) or fluorophore-labeled probe (Vysis, Downers Grove, IL) were performed in accordance with the manufacturer's instructions. Statistical analyses were performed using SPSS 7.5 statistical software (Chicago, IL). Mean whole-cell areas ranged from 796 μm2 (Hep3B) to 396 μm2 (MCF-7), and the mean tumor cell/leukocyte area ratio was 5.7 for Hep3B, 4.5 for HepG2 and HeLa, 4.1 for LNCaP, and 2.8 for MCF-7. A significant (P < 0.001) difference in whole-cell area was found between tumor cells from any of the carcinoma cell lines and PBLs (Figure 1A). Sensitivity tests performed on individually collected cultured cells showed that the sensitivity threshold of ISET is close to one carcinoma cell per milliliter. In fivefold replicate tests using one cell, we found one LNCaP cell five times, one HepG2 cell four times, and one MCF-7 cell three times. In fivefold replicate tests using three cells, we found three LNCaP cells three times (two cells and one cell once), three HepG2 cells four times (one cell once), and three MCF-7 cells four times (no cells one time), using ISET (Table 2). In contrast, RT-nested PCR protocols were incapable of detecting either one or three individually collected HepG2 or LNCaP cells when mixed with such a small volume of blood (1 ml) (Figure 1B, Table 2).Table 2In Vitro and in Vivo Sensitivity of ISETNo. of cells detected by ISETHep G2LNC aPMCF-7a. In vitro testsNo. of micropipetted cells33 (−)1 (−)33 (−)3 (−)33 (−)3 (−)01 (−)3 (−)33 (−)2 (−)311 (−)1 (−)11 (−)1 (−)10 (−)1 (−)01 (−)1 (−)11 (−)1 (−)0b. In vivo tests in patients with liver cancerNo. of tumor cells (*) and tumor microemboli (°) detected by ISETPatientBefore surgeryDuring tumor resection14° (−)3*+ 5° (−)20 (−)1* (−)30 (−)1*+ 12° (−)41° (−)0 (−)50 (−)2* (+)61° (−)2° (+)70 (−)2* (+)RT-PCR results are in parentheses. ISET tests were performed in 1 ml peripheral blood samples. RT-PCR in vitro and in vivo tests were performed in 1 and 3 ml of blood, respectively. Open table in a new tab RT-PCR results are in parentheses. ISET tests were performed in 1 ml peripheral blood samples. RT-PCR in vitro and in vivo tests were performed in 1 and 3 ml of blood, respectively. Morphological analysis of epithelial cells, after H&E staining, showed that cell morphology is undamaged after ISET. An average number of 0.0002% leukocytes is also retained on the membrane, often trapped in the pore lumen. However, they are easy to recognize because of their size and nuclear morphology. All carcinoma cells were positive for KL1 immunostaining. The fine granular cytoplasmic staining was particularly intense in MCF-7 cells and much weaker in LNCaP. No KL1 staining was detected in PBL, except in some leukocytes trapped in the membrane pores. In double staining with anti-AFP or KL1 and anti-LCA antobodies (Figure 2c), anti-LCA gives a clear cell membrane labeling and a weak cytoplasmic staining. With anti-human matrix metalloproteinase 3 we observed a cytoplasmic diffuse staining in LNCaP (Figure 2d) and HepG2 cells. We studied Hep3B cells, which carry a p53 deletion previously described by Southern blot,12Bressac B Galvin KM Liang TJ Isselbacher KJ Wands JR Ozturk M Abnormal structure and expression of p53 gene in human hepatocellular carcinoma.Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87: 1973-1977Crossref PubMed Scopus (379) Google Scholar and HepG2 cells, the p53 gene of which is nonrearranged. In a preliminary test, we mapped the Hep3B p53 deletion by PCR with 10 exon-specific primer sets and observed that the homozygous deletion spans the area from exon 7 to exon 11 (data not shown). We then applied primers specific to p53 exons 8 and 9, in coamplification with HLA primers, to DNA obtained from single Hep3B cells isolated using ISET and laser microdissection13Schütze K Posl H Lahr G Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and medicine.Cell Mol Biol. 1998; 44: 735-746PubMed Google Scholar (Figure 3, A and B). Our results demonstrate the p53 deletion in individually collected Hep3B cells. We determined whether FISH could be applied to cells isolated using the ISET protocol. Figure 3C shows the data obtained using two, well characterized breast (MCF-7)- and liver (HepG2)-derived tumor cell lines. FISH, performed using a probe specific for the chromosome 1 centromere, clearly showed three and two chromosomes 1 in MCF-7 and HepG2, respectively, in line with previously reported results.14Leger I Thomas M Ronot X Brugal G Detection of chromosome 1 aberrations by fluorescent in situ hybridization (FISH) in the human breast cancer cell line MCF-7.Anal Cell Pathol. 1993; 5: 299-309PubMed Google Scholar Liver-derived cells with cytological features characteristic of tumor cells, reacting or not with anti-AFP antibody, were identified in the peripheral blood of patients before and during surgery (Table 2 and Figure 2, f-h). Tumor emboli were also found, and in some instances these demonstrated features reproducing the histological lobular structure observed in tumorous tissue from the same patient (Figure 2, f and e). The number of tumor emboli and tumor cells recovered before and during tumor resection is shown in Table 2. In addition, a variable number of hepatoid cells was found in certain peripheral blood samples (data not shown). When compared with AFP RT-PCR tests, performed in parallel on the same peripheral blood samples, ISET produced more sensitive and specific results (Table 2). Finally, peripheral blood from eight healthy volunteers and eight patients with chronic hepatitis but without liver cancer scored negative with both ISET and AFP RT-PCR. We describe a new method, called ISET, for isolating by size circulating tumorous cells in patients with carcinoma. In fact, morphometric analyses of tumor cell lines derived from liver, prostate, breast, and cervix human carcinomas have confirmed the significantly larger cell size of these carcinoma cells as compared to peripheral blood leukocytes. This method is easy to perform, rapid, and inexpensive and makes it possible to directly isolate and count tumor cells in patients with different types of carcinoma. In previous studies7Rostagno P Moll J Bisconte J Caldani C Detection of rare circulating breast cancer cells by filtration cytometry and identification by DNA content: sensitivity in an experimental model.Anticancer Res. 1997; 17: 2481-2485PubMed Google Scholar, 15Rye P Hoifodt H Overli G Fodstad O Immunobead filtration: a novel approach for the isolation and propagation of tumor cells.Am J Pathol. 1997; 150: 99-106PubMed Google Scholar filtration analyses have been applied to tumor and/or epithelial cells obtained from peripheral blood by immunomagnetic selection. Filtration has been used to eliminate contaminating leukocytes and beads. ISET is the first test allowing direct filtration of peripheral blood that avoids immunomagnetic and flow cytometric cell separation.16Brandt B Roetger A Heidl S Jackisch C Lelle R Assmann G Zänker K Isolation of blood-borne epithelium-derived c-erbB-2 oncoprotein-positive clustered cells from peripheral blood of breast cancer patients.Int J Cancer. 1998; 76: 824-828Crossref PubMed Scopus (78) Google Scholar, 17Racila E Euhus D Weiss A Rao C McConnell J Terstappen L Uhr J Detection and characterization of carcinoma cells in the blood.Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 4589-4594Crossref PubMed Scopus (575) Google Scholar, 18Wong L Bateman W Morris A Fraser I Detection of circulating tumor cells with the magnetic activated cell sorter.Br J Surg. 1995; 82: 1333-1337Crossref PubMed Scopus (42) Google Scholar, 19Melchior S Corey E Ellis W Ross A Layton T Oswin M Lange P Vessella R Early tumor cell dissemination in patients with clinically localized carcinoma of the prostate.Clin Cancer Res. 1997; 3: 249-256PubMed Google Scholar Avoiding these steps, the efficiency of which often depends on the expression of selected antigens (eg, BerEP4) on the tumor cell membrane, ISET makes it possible minimize cell loss. Actually, one of the most valuable advantages of ISET is its ability to isolate epithelial cells without damaging cell morphology, a property that is connected to its high sensitivity. Thus we repeatedly detected by ISET a single carcinoma cell collected under a microscope and mixed with 1 ml of peripheral blood before filtration. In contrast, RT-PCR analyses failed to detect a single cell when diluted in only 1 ml of blood. ISET succeeded in isolating tumor cells from all tested human carcinoma-derived cell lines (HepG2, Hep3B, HeLa, LNCaP, MCF-7), including MCF-7, the size of which is only two times that of leukocytes. Our results therefore suggest that ISET is potentially suitable for application to tumor cells from a wide range of human carcinomas. Clearly, however, this methodology should not be suitable for studies on small neuroendocrine tumor cells. Further studies, focusing on additional cell lines and patients with a variety of carcinoma types, have to be performed to define the size threshold of ISET application. Immunocytochemistry and immunofluorescence can detect tissue-specific antigens and markers of invasiveness,20Woodhouse E Chuaqui R Liotta L General mechanisms of metastasis.Cancer. 1997; 80: 1529-1537Crossref PubMed Google Scholar angiogenesis,21Kumar R Fidler I Angiogenic molecules and cancer metastasis.In Vivo. 1998; 12: 27-34PubMed Google Scholar apoptosis, and cell proliferation22Luzzi K MacDonald I Schmidt E Kerkvliet N Morris V Chambers A Groom A Multistep nature of metastatic inefficiency. Dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases.Am J Pathol. 1998; 153: 865-873Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (909) Google Scholar in individual isolated CTCs. We also demonstrated the feasibility of cytogenetic studies in CTCs by applying the FISH protocol to this material. Furthermore, we performed PCR-based genetic analyses on individual laser-microdissected cells isolated with ISET. In patients with liver cancer undergoing tumor resection, ISET (but not AFP RT-nested PCR) has demonstrated the iatrogenous spread of tumor cells and tumor microemboli, which is of potential importance to the prevention of tumor recurrence after surgery. In conclusion, this new technique provides an unique opportunity for cytological analysis of peripheral blood in oncology and for combining immunomorphological studies with novel assays exploring genetic abnormalities in individual isolated cells. The potential uses for ISET go well beyond the field of oncology, because it also allows the isolation of large, circulating, nontumorous cells. For example, the isolation of trophoblastic cells from the peripheral blood of pregnant women has been initiated in our laboratory and may constitute an important step toward improving the prenatal diagnosis of genetic diseases. We thank Dr. J.C. Bisconte for support and helpful discussion and Dr. B. Bressac for providing the p53 primers.

Some epidemiologic studies suggest a link between hepatitis C virus (HCV) infection and some B-cell non-Hodgkin's lymphomas. We undertook this study after a patient with splenic lymphoma with villous lymphocytes had a hematologic response after antiviral treatment of HCV infection.

Liver steatosis, which involves accumulation of intracytoplasmic lipid droplets, is characteristic of hepatitis C virus (HCV) infection. By use of an in vivo transgenic murine model, we demonstrate that hepatic overexpression of HCV core protein interferes with the hepatic assembly and secretion of triglyceride-rich very low density lipoproteins (VLDL). Core expression led to reduction in microsomal triglyceride transfer protein (MTP) activity and in the particle size of nascent hepatic VLDL without affecting accumulation of MTP and protein disulfide isomerase. Hepatic human apolipoprotein AII (apo AII) expression in double-core/apo AII transgenic mice diminished intrahepatic core protein accumulation and abrogated its effects on VLDL production. Apo AII and HCV core colocalized in human HCV-infected liver biopsies, thus testifying to the relevance of this interaction in productive HCV infection. Our results lead us to propose a new pathophysiological animal model for induction of viral-related steatosis whereby the core protein of HCV targets microsomal triglyceride transfer protein activity and modifies hepatic VLDL assembly and secretion.

HepatologyVolume 3, Issue 3 p. 279-284 Original ArticlesFree Access Detection of Hepatitis B Virus DNA in Serum by a Simple Spot Hybridization Technique: Comparison with Results for Other Viral Markers Jacques Scotto, Corresponding Author Jacques Scotto Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Dr. Jacques Scotto, INSERM U 56, Hǒpital de Bicětre, F 94270 Le Kremlin-Bicětre, France.===Search for more papers by this authorMichelle Hadchouel, Michelle Hadchouel Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Search for more papers by this authorChristiane Hery, Christiane Hery Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Search for more papers by this authorJeannine Yvart, Jeannine Yvart Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Search for more papers by this authorPierre Tiollais, Pierre Tiollais Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Search for more papers by this authorChristian Brechot, Christian Brechot Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Search for more papers by this author Jacques Scotto, Corresponding Author Jacques Scotto Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Dr. Jacques Scotto, INSERM U 56, Hǒpital de Bicětre, F 94270 Le Kremlin-Bicětre, France.===Search for more papers by this authorMichelle Hadchouel, Michelle Hadchouel Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Search for more papers by this authorChristiane Hery, Christiane Hery Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Search for more papers by this authorJeannine Yvart, Jeannine Yvart Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Search for more papers by this authorPierre Tiollais, Pierre Tiollais Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Search for more papers by this authorChristian Brechot, Christian Brechot Unité de Recherche d'Hépatologie Infantile (INSERM U 56) & Clinique de Pédiatrie, Université Paris-Sud, Hǒpital d'Enfants and Service de Médecine Nucléaire, CHU de Bicětre, Bicětre, France, F 94270; and Unité de Recombinaison et Expression Génétique (INSERM U163), Institut Pasteur, Paris, France, F 75015Search for more papers by this author First published: 1983 https://doi.org/10.1002/hep.1840030301Citations: 268AboutPDF ToolsRequest permissionExport citationAdd to favoritesTrack citation ShareShare Give accessShare full text accessShare full-text accessPlease review our Terms and Conditions of Use and check box below to share full-text version of article.I have read and accept the Wiley Online Library Terms and Conditions of UseShareable LinkUse the link below to share a full-text version of this article with your friends and colleagues. Learn more.Copy URL Share a linkShare onFacebookTwitterLinked InRedditWechat Abstract A simplified spot method for determination in serum of hepatitis B virus DNA (HBV DNA) by molecular hybridization is proposed. For simultaneous testing of 30 serum samples, it reduced to about 1 hr the duration of the steps preceding hybridization proper. The method also greatly reduced the loss of DNA during these steps and allowed more sensitive detection in samples of only 25 or 50 m̈1. HBV DNA was determined in 181 serum samples by this method, and the results were pooled with 67 previous determinations by the Southern blot technique. Results for the pool were then compared to those obtained with radioimmunoassay for serological HBV markers. Ninety-six of the 248 samples were HBV DNA positive. Eleven others gave variable or inconclusive results, probably due to low viral particle titers. Seventy-two HBsAg- and HBeAg-positive sera contained HBV DNA, confirming that HBeAg is a marker of active viral replication. Fourteen other HBsAg- and HBeAg-positive sera, obtained from eight patients, were either HBV DNA negative or oscillated between negative and positive, or, again, were weakly positive; serological follow-up in 7 patients showed seroconversion to anti-HBe in 5, 3 of which became HBsAg negative. Eight of the HBsAg-positive sera were negative or borderline for HBeAg but contained HBV DNA and may, therefore, have been infective; seven of these sera had anti-HBe. Six HBsAg-negative sera contained HBV DNA and may also have been infective; five of these exhibited HBV antibodies. These results indicate that molecular hybridization not only provides a more sensitive and direct method for detecting hepatitis B virus in serum but also defines additional serological patterns with predictive or epidemiological value. Citing Literature Volume3, Issue31983Pages 279-284 ReferencesRelatedInformation

We assessed the presence of hepatitis B virus (HBV) DNA in liver or serum samples from 134 patients with hepatitis B surface antigen (HBsAg)-negative chronic liver disease, including 20 with hepatocellular carcinoma. HBV DNA sequences were detected in 52 of the 88 liver samples (59 per cent), including 17 of the 20 samples from patients with hepatocellular carcinoma. Presumably "replicative forms" of HBV DNA were detected in only 5 of the 88 liver samples, 3 of which were from patients with no serologic marker for HBV. In most of the liver samples the DNA patterns were consistent with the presence of HBV or a closely related virus. Of the 105 serum samples tested, HBV DNA sequences were identified in 10 (9.5 per cent), 6 of which had no HBV serologic marker. Moreover, HBsAg-associated determinants were detected in 5 of 17 patients who were positive for HBV DNA and in none of 14 patients who were negative. This study demonstrates the high frequency of HBsAg-negative HBV DNA-positive viral infection of the liver and suggests that multiplication of HBV may occur in the absence of any conventional serologic marker for HBV.

We investigated the infection of peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) by hepatitis C virus (HCV) in 5 patients with HCV-related chronic hepatitis. The presence of HCV-RNA-positive and -negative strands was tested with the polymerase chain reaction (PCR) method. In all subjects, HCV-RNA was shown in PBMNC. In 3 cases, HCV-RNA was shown in the T-and B-cell populations, with viral RNA also present in the monocyte-macrophage fraction of two of these. HCV-RNA-negative stranded molecules, indicative of the viral multiplication, were significantly increased in cells maintained in cultures with PHA/PMA stimulation. The results indicate that HCV infect blood mononuclear cells, thus suggesting that this cellular tropism may play a role in HCV infection

Chronic hepatitis B virus (HBV) infection is a global public health challenge on the same scale as tuberculosis, HIV, and malaria. The International Coalition to Eliminate HBV (ICE-HBV) is a coalition of experts dedicated to accelerating the discovery of a cure for chronic hepatitis B. Following extensive consultation with more than 50 scientists from across the globe, as well as key stakeholders including people affected by HBV, we have identified gaps in our current knowledge and new strategies and tools that are required to achieve HBV cure. We believe that research must focus on the discovery of interventional strategies that will permanently reduce the number of productively infected cells or permanently silence the covalently closed circular DNA in those cells, and that will stimulate HBV-specific host immune responses which mimic spontaneous resolution of HBV infection. There is also a pressing need for the establishment of repositories of standardised HBV reagents and protocols that can be accessed by all HBV researchers throughout the world. The HBV cure research agenda outlined in this position paper will contribute markedly to the goal of eliminating HBV infection worldwide.