ADVERTISEMENT RETURN TO ISSUEPREVArticleNEXTIsolation and structure of bryostatin 1George R. Pettit, Cherry L. Herald, Dennis L. Doubek, Delbert L. Herald, Edward Arnold, and Jon ClardyCite this: J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 24, 6846–6848Publication Date (Print):December 1, 1982Publication History Published online1 May 2002Published inissue 1 December 1982https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ja00388a092https://doi.org/10.1021/ja00388a092research-articleACS PublicationsRequest reuse permissionsArticle Views2414Altmetric-Citations557LEARN ABOUT THESE METRICSArticle Views are the COUNTER-compliant sum of full text article downloads since November 2008 (both PDF and HTML) across all institutions and individuals. These metrics are regularly updated to reflect usage leading up to the last few days.Citations are the number of other articles citing this article, calculated by Crossref and updated daily. Find more information about Crossref citation counts.The Altmetric Attention Score is a quantitative measure of the attention that a research article has received online. Clicking on the donut icon will load a page at altmetric.com with additional details about the score and the social media presence for the given article. Find more information on the Altmetric Attention Score and how the score is calculated. Share Add toView InAdd Full Text with ReferenceAdd Description ExportRISCitationCitation and abstractCitation and referencesMore Options Share onFacebookTwitterWechatLinked InRedditEmail Other access optionsGet e-AlertscloseSupporting Info (1)»Supporting Information Supporting Information Get e-Alerts

Anti-AIDS drug candidate and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor (NNRTI) TMC125-R165335 (etravirine) caused an initial drop in viral load similar to that observed with a five-drug combination in naïve patients and retains potency in patients infected with NNRTI-resistant HIV-1 variants. TMC125-R165335 and related anti-AIDS drug candidates can bind the enzyme RT in multiple conformations and thereby escape the effects of drug-resistance mutations. Structural studies showed that this inhibitor and other diarylpyrimidine (DAPY) analogues can adapt to changes in the NNRTI-binding pocket in several ways: (1) DAPY analogues can bind in at least two conformationally distinct modes; (2) within a given binding mode, torsional flexibility ("wiggling") of DAPY analogues permits access to numerous conformational variants; and (3) the compact design of the DAPY analogues permits significant repositioning and reorientation (translation and rotation) within the pocket ("jiggling"). Such adaptations appear to be critical for potency against wild-type and a wide range of drug-resistant mutant HIV-1 RTs. Exploitation of favorable components of inhibitor conformational flexibility (such as torsional flexibility about strategically located chemical bonds) can be a powerful drug design concept, especially for designing drugs that will be effective against rapidly mutating targets.

Recent studies indicate that nitric oxide (NO) and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate (cGMP) may inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells (SMC) in vitro. The purpose of this study was to investigate the mechanism of NO- and cGMP-dependent inhibition of cultured rat aortic SMC. The cytokine interleukin-1 beta (IL-1 beta) inhibited serum- and platelet-derived growth factor-stimulated [3H]thymidine incorporation into DNA in subcultured rat aortic SMC. Incubation with IL-1 beta for 24 h markedly increased cGMP levels but not adenosine 3',5'-cyclic monophosphate (cAMP) levels. However, the IL-1 beta-induced increase in cGMP was correlated with an activation of the cAMP-dependent protein kinase (cAMP kinase) activity ratio. The activation of the cAMP kinase was prevented by treatments that blocked NO and cGMP production. The NO-generating vasodilator, S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP) also inhibited DNA synthesis and elevated cGMP levels. The inhibition of DNA synthesis by both IL-1 beta and SNAP was observed only when cGMP levels were elevated to high levels (10-fold or more). As was the case for IL-1 beta, SNAP increased the activity ratio of cAMP kinase. Selective inhibition of cAMP kinase using (R)-p-bromoadenosine 3',5'-cyclic monophosphorothioate prevented the inhibition of proliferation by IL-1 beta. By contrast, the inhibitor of the cGMP-dependent protein kinase, (R)-p-bromoguanosine 3',5'-cyclic monophosphorothioate, had no effect on IL-1 beta-induced inhibition of cellular proliferation. These studies suggest that cGMP-dependent activation of the cAMP kinase may be responsible in part at least for the NO-dependent inhibition of proliferation of subcultured rat aortic SMC.

WIN 51711 and WIN 52084 are structurally related, antiviral compounds that inhibit the replication of rhino (common cold) viruses and related picornaviruses. They prevent the p H-mediated uncoating of the viral RNA. The compounds consist of a 3-methylisoxazole group that inserts itself into the hydrophobic interior of the VP1 β-barrel, a connecting seven-membered aliphatic chain, and a 4-oxazolinylphenoxy group (OP) that covers the entrance to an ion channel in the floor of the "canyon." Viral disassembly may be inhibited by preventing the collapse of the VP1 hydrophobic pocket or by blocking the flow of ions into the virus interior.

Article15 March 2001free access Crystal structure of HIV-1 reverse transcriptase in complex with a polypurine tract RNA:DNA Stefan G. Sarafianos Stefan G. Sarafianos Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Kalyan Das Kalyan Das Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Chris Tantillo Chris Tantillo Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Arthur D. Clark Jr Arthur D. Clark Jr Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Jianping Ding Jianping Ding Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Jeannette M. Whitcomb Jeannette M. Whitcomb ViroLogic, Inc., 270 E. Grand Avenue, S. San Francisco, CA, 94080 USA Search for more papers by this author Paul L. Boyer Paul L. Boyer HIV Drug Resistance Program, NCI-Frederick Cancer Research and Development Center, PO Box B, Frederick, MD, 21702-1201 USA Search for more papers by this author Stephen H. Hughes Stephen H. Hughes HIV Drug Resistance Program, NCI-Frederick Cancer Research and Development Center, PO Box B, Frederick, MD, 21702-1201 USA Search for more papers by this author Edward Arnold Corresponding Author Edward Arnold Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Stefan G. Sarafianos Stefan G. Sarafianos Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Kalyan Das Kalyan Das Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Chris Tantillo Chris Tantillo Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Arthur D. Clark Jr Arthur D. Clark Jr Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Jianping Ding Jianping Ding Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Jeannette M. Whitcomb Jeannette M. Whitcomb ViroLogic, Inc., 270 E. Grand Avenue, S. San Francisco, CA, 94080 USA Search for more papers by this author Paul L. Boyer Paul L. Boyer HIV Drug Resistance Program, NCI-Frederick Cancer Research and Development Center, PO Box B, Frederick, MD, 21702-1201 USA Search for more papers by this author Stephen H. Hughes Stephen H. Hughes HIV Drug Resistance Program, NCI-Frederick Cancer Research and Development Center, PO Box B, Frederick, MD, 21702-1201 USA Search for more papers by this author Edward Arnold Corresponding Author Edward Arnold Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA Search for more papers by this author Author Information Stefan G. Sarafianos1, Kalyan Das1, Chris Tantillo1, Arthur D. Clark1, Jianping Ding1, Jeannette M. Whitcomb2, Paul L. Boyer3, Stephen H. Hughes3 and Edward Arnold 1 1Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM) and Rutgers University Chemistry Department, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ, 08854-5638 USA 2ViroLogic, Inc., 270 E. Grand Avenue, S. San Francisco, CA, 94080 USA 3HIV Drug Resistance Program, NCI-Frederick Cancer Research and Development Center, PO Box B, Frederick, MD, 21702-1201 USA *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2001)20:1449-1461https://doi.org/10.1093/emboj/20.6.1449 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info We have determined the 3.0 Å resolution structure of wild-type HIV-1 reverse transcriptase in complex with an RNA:DNA oligonucleotide whose sequence includes a purine-rich segment from the HIV-1 genome called the polypurine tract (PPT). The PPT is resistant to ribonuclease H (RNase H) cleavage and is used as a primer for second DNA strand synthesis. The ‘RNase H primer grip’, consisting of amino acids that interact with the DNA primer strand, may contribute to RNase H catalysis and cleavage specificity. Cleavage specificity is also controlled by the width of the minor groove and the trajectory of the RNA:DNA, both of which are sequence dependent. An unusual ‘unzipping’ of 7 bp occurs in the adenine stretch of the PPT: an unpaired base on the template strand takes the base pairing out of register and then, following two offset base pairs, an unpaired base on the primer strand re-establishes the normal register. The structural aberration extends to the RNase H active site and may play a role in the resistance of PPT to RNase H cleavage. Introduction HIV-1 reverse transcriptase (RT) is a multifunctional enzyme that is responsible for copying the single-stranded viral RNA genome into double-stranded DNA (Telesnitsky and Goff, 1997). RT contains a DNA polymerase that can copy either an RNA or DNA template and a ribonuclease H (RNase H) activity that cleaves the RNA strand in RNA:DNA hybrids. In addition to degrading the RNA genome after it has been copied to DNA, the RNase H cleavages define the ends of the double-stranded genome that are the substrates for integration into the host genome. In vivo studies demonstrate that inactivation of RNase H results in non-infectious virus particles (Tanese and Goff, 1988; Schatz et al., 1989). HIV-1 RT is a heterodimer consisting of p66 and p51 subunits. Both subunits are derived from a gag-pol polyprotein, which is cleaved by the viral protease. The two subunits have a common N-terminus; p51 lacks the C-terminal RNase H domain present in p66. Crystal structures of HIV-1 RT complexes with DNA:DNA have been determined in the presence (Huang et al., 1998) and absence (Jacobo-Molina et al., 1993; Ding et al., 1998) of a bound dNTP. While both subunits contain fingers, palm, thumb and connection subdomains, the arrangement of the subdomains in the two subunits is very different (Kohlstaedt et al., 1992; Jacobo-Molina et al., 1993). The crystal structure of the binary complex of HIV-1 RT and a DNA:DNA substrate showed that the DNA:DNA substrate is bent by ∼40° (Jacobo-Molina et al., 1993; Ding et al., 1998). Near the polymerase active site the duplex adopts A-form geometry; near the RNase H active site the duplex adopts B-form geometry (Ding et al., 1997). The structure of the isolated RNase H domain of HIV-1 RT was solved (Davies et al., 1991) before the structure of the intact HIV-1 RT was known. The HIV-1 RNase H domain has a structure that is very similar to the RNase HI of Escherichia coli (Katayanagi et al., 1990; Yang et al., 1990) and of Thermus thermophilus (Ishikawa et al., 1993), but none of the RNases H has been cocrystallized with RNA:DNA, their natural substrate, and there are no published structures of HIV-1 RT in complex with an RNA:DNA duplex. Polypurine tract in retroviral replication Viral DNA synthesis (see Figure 1) is initiated from a cellular tRNA base paired to the genome of HIV-1 at the primer binding site (PBS). As the minus (−) DNA strand is synthesized, the RNA strand is digested by RNase H. The PBS is near the 5′ end of the genome. Degradation of the RNA by RNase H allows DNA synthesis to be transferred to the 3′ end of the RNA. After strand transfer, (−) strand synthesis can continue, accompanied by RNase H degradation of the RNA genome, but the degradation is not complete. The purine-rich polypurine tract (PPT) is resistant to RNase H cleavage and serves as the primer for plus (+) strand synthesis (reviewed in Telesnitsky and Goff, 1997). The PPT sequence is just 5′ of U3 (Figure 1). Removal of the PPT primer by RNase H defines the left end of the upstream long terminal repeat (LTR) (Figure 1E), which, together with the downstream LTR, is the substrate for the viral integrase enzyme that inserts the linear viral DNA in the host genome. Unlike many retroviruses that have only one PPT sequence, HIV-1 has a second copy of the PPT (central PPT) located near the center of the genome (Charneau et al., 1992). Mutations replacing purines by pyrimidines in the HIV-1 and TY1 central PPTs, which do not modify amino acid sequence, slow down viral growth (Charneau et al., 1992; Hungnes et al., 1992; Heyman et al., 1995), suggesting that the central PPT is important, but not necessary for replication of retroviruses. While the sequence of multiple copies of PPTs is identical, it is likely that the relative importance of a PPT is determined by the neighboring sequences that flank different copies of PPT. Figure 1.Process of reverse transcription of the HIV-1 genome. (A) Minus strand DNA synthesis (DNA strand in red) is initiated using a cellular tRNA annealed to the PBS. The RNA strand of the RNA:DNA duplex is degraded by RNase H of HIV-1 RT. (B) First strand transfer allows annealing of the newly formed DNA to the 3′ end of the viral genome. Transfer is mediated by identical repeated (R) sequences. (C) Minus strand DNA synthesis resumes, accompanied by RNase H digestion of all template RNA except PPT. (D) PPT is used as a primer for second strand DNA synthesis. (E) RNase H removes the tRNA and the PPT. In HIV-1, a single RNA nucleotide (from tRNA) is left by RNase H at the RNA/DNA PBS junction. (F) During second strand transfer (not shown) the newly formed PBS DNA (second strand) anneals to the PBS DNA from the first strand. Completion of second strand synthesis results in a linear DNA duplex with LTRs at both ends. Download figure Download PowerPoint There are at least three requirements for the end of the viral genome to be synthesized correctly. First, the PPT RNA must be resistant to cleavage by RNase H during (−) strand DNA synthesis (Figure 1C). Secondly, RNase H cleavage must occur precisely at the end of the PPT to generate the correct primer for the proper initiation of (+) strand DNA synthesis (Figure 1C). Thirdly, after the PPT primer has been used to initiate DNA synthesis, it must be precisely removed from the end of the viral DNA (Figure 1E). These three requirements have been extensively studied using biochemical methods in the HIV-1, avian sarcoma leukosis virus (ASLV) and Moloney murine leukemia virus (MuLV) systems (reviewed in Telesnitsky and Goff, 1997). The PPT is relatively resistant to RNase H degradation in vitro, although cleavages within the PPT can occur (Champoux et al., 1984; Resnick et al., 1984; Rattray and Champoux, 1989; Wöhrl and Moelling, 1990; Fuentes et al., 1995; Gao et al., 1998, 1999). There is evidence to suggest that both RT and the PPT are important for determining the specificity of cleavage and for controlling plus strand priming: (i) mutations at the primer grip or thumb subdomain of RT dramatically affect the ability of the enzyme to cleave specifically at the 3′ end of the PPT (Ghosh et al., 1997; Palaniappan et al., 1997; Powell et al., 1997, 1999; Gao et al., 1998); (ii) the isolated RNase H domain of MuLV RT exhibits different cleavage specificity of PPT than the intact MuLV RT (Zhan and Crouch, 1997); (iii) with the exception of a few changes at the G-rich 3′ end of PPT, most single base mutations of the PPT sequence can be tolerated without altering the specificity of cleavage and plus strand priming by HIV-1 RT (Huber et al., 1989; Rattray and Champoux, 1989; Luo et al., 1990; Wöhrl and Moelling, 1990; Pullen et al., 1993; Powell and Levin, 1996); and finally, (iv) the NMR structure of an 8 bp RNA:DNA oligonucleotide containing the last four residues of PPT (with a mutation of one G to A) and the first 4 bp of U3, shows that the width and shape of the major groove is unusual (Fedoroff et al., 1997). Despite the considerable body of experimental data, however, the molecular details of PPT recognition remain unclear both in terms of the generation of the primer and its removal. Mechanism and specificity of RNase H cleavage NMR structural studies (Fedoroff et al., 1993; Lane et al., 1993) have suggested that RNA:DNA duplexes are neither A- nor B-form structures in solution. This led to the hypothesis that RNase H distinguishes DNA:RNA and RNA:RNA duplexes by recognizing differences in the width of the minor groove, and suggested that a minor groove width of ∼9–10 Å should be optimal for efficient recognition by RNase H (Fedoroff et al., 1993, 1997; Salazar et al., 1994; Zhu et al., 1995; Horton and Finzel, 1996; Han et al., 1997; Bachelin et al., 1998; Szyperski et al., 1999). In some cases, however, RNase H can cleave single-stranded RNA adjacent to the RNA:DNA duplex region, albeit with low efficiency (Gao et al., 1997; Lima and Crooke, 1997). Furthermore, under certain conditions the RNases H of both MuLV RT and HIV-1 RT can cleave an RNA:RNA substrate (Ben-Artzi et al., 1992; Blain and Goff, 1993; Smith and Roth, 1993; Hostomsky et al., 1994; Götte et al., 1995). Finally, HIV-1 RT can cleave chimeric hybrid duplexes (RNA-DNA annealed to DNA) at the RNA/DNA junction where the minor grooves tend to be very narrow [as small as 4.5–5.5 Å (Szyperski et al., 1999)] and bent (Salazar et al., 1994; Szyperski et al., 1999). These data suggest that the specificity of RNase H cleavage does not depend solely on the width of the minor groove (Szyperski et al., 1999). In an effort to study the interactions of HIV-1 RT with RNA:DNA, to discern the molecular details of PPT recognition and to understand better the mechanism and specificity of RNase H cleavage, we determined the 3.0 Å crystal structure of HIV-1 RT in complex with a PPT-containing RNA:DNA substrate and the Fab fragment of a monoclonal antibody. The PPT-containing RNA:DNA oligonucleotide (r31:d29) was bound to HIV-1 RT with the 3′ end of DNA at the polymerase active site and the middle part of the PPT (defined as a stretch of rAs) near the RNase H active site (Figure 2). This binding mode was designed to investigate the inefficient cleavage of the PPT by HIV RNase H. This complex has extensive protein– nucleic acid interactions, and the nucleic acid has unusual structural features that provide a basis for understanding why the PPT is resistant to degradation by HIV-1 RNase H. Figure 2.Top: HIV genome sequence at the PPT (underlined) and U3 region. The minus strand synthesis initiation site is marked with an asterisk; +1 is the first nucleotide of U3. Bottom: sequence of the RNA:DNA oligonucleotide in our RT–RNA:DNA complex. Download figure Download PowerPoint Results and discussion Overall structure of the HIV-1 RT–RNA:DNA complex The overall conformation of the protein in the HIV-1 RT–RNA:DNA complex (Figure 3) is similar to that in the HIV-1 RT–DNA:DNA complex. There are extensive interactions between the nucleic acid and amino acids of all subdomains of the p66 subunit; there are also interactions between the nucleic acid and the fingers and connection subdomains of the p51 subunit (Figures 3 and 4). The nucleic acid binding cleft is ∼60 Å in length, extending from the polymerase active site to the RNase H active site. The distance in nucleotides between the polymerase and RNase H catalytic sites in this structure is 18 bp, which agrees with past biochemical studies with HIV-1 RT (Schatz et al., 1990; Wöhrl and Moelling, 1990; Gopalakrishnan et al., 1992; Ghosh et al., 1995; Götte et al., 1995; Gao et al., 1998, 1999). In HIV-1 RT complexes containing double-stranded DNA template-primers, the distance between the polymerase and RNase H active sites is 17 bp (Jacobo-Molina et al., 1993; Huang et al., 1998). This nucleic acid-dependent difference in the distance between the polymerase and RNase H active sites agrees with previous biochemical studies (Götte et al., 1998). The final model of RNA:DNA template-primer includes 45 nucleotides (23 template, 22 primer) encompassing more than two full helical turns of RNA:DNA. The major groove is exposed to the solvent, as might be expected for a non-specific DNA binding protein. The electron density of the nucleic acid is stronger in regions where there are extensive interactions with the enzyme, including the polymerase and RNase H active sites. Simulated annealing omit maps for nucleotides in key locations are shown in Figure 5. Figure 3.Stereo view of a ribbon representation of the structure of HIV-1 RT in complex with the polypurine RNA:DNA. The fingers, palm, thumb, connection and RNase H subdomains of p66 are colored blue, red, green, yellow and orange, respectively. The p51 subunit is colored gray. The RNA template and DNA primer strands are shown in magenta and blue, respectively. Download figure Download PowerPoint Figure 4.The sequence and numbering scheme of the RNA:DNA PPT and the interactions between the nucleic acid and amino acid residues of HIV-1 RT (≤3.8 Å). The RNA (orange) and DNA (cyan) strands are designated Tem and Pri, respectively. The nucleotide site positions are labeled with ascending numbers from the polymerase domain toward the RNase H domain. Amino acids of the p51 subunit are designated by an asterisk following the residue number; all others are in p66. RNase H nucleotide site positions are designated positive (+1 to +4) for positions 3′ to, and negative (−1 to −9) for positions 5′ to, the scissile phosphate, where the 3′ and 5′ orientations are for the RNA strand. Hydrogen bonds are shown in red dashed lines and other types of interaction are shown in solid black lines. 2′-OH groups of RNA and phosphate groups are shown in red and gray spheres. Weakly paired (distance ≥3.6 Å), mismatched and unpaired bases are shown filled with stripes, spheres and empty, respectively. Residues Gly359 and Ala360 of the RNase H primer grip interact with the nucleic acid through their main-chain atoms. Arg284 was modeled as Ala because of weak density for the side chain. N474 interacts with Pri15-Thy through a water molecule (not shown). Download figure Download PowerPoint Figure 5.Simulated annealing (Fo − Fc) omit electron density maps contoured at the 2σ level at the polymerase active site (1) (omitting nucleic acid) and of the unpaired residue of template (2) (omitting unpaired residue Tem-15-Ade). Download figure Download PowerPoint RT has similar interactions with the DNA primer strand in RT–RNA:DNA and RT–DNA:DNA structures While the contacts between RT and the DNA primer strands are very similar in the RT complexes with RNA:DNA and DNA:DNA template-primers, the contacts with the RNA template (Figures 3 and 4) are different from those with the DNA template. However, there are relatively modest changes in the protein structure. As seen in the RT–DNA:DNA structure, many of the RT contacts with the nucleic acid in the RT–RNA:DNA complex involve the sugar–phosphate backbone, consistent with the fact that RT can copy a wide variety of different templates. RT has numerous interactions with 2′-OH groups of the RNA template in the RT–RNA:DNA complex. Such interactions (indicated in magenta in Figure 6) include residues 280 and 284 of helix I of the p66 thumb, residues of the template grip including 89 and 91 of the p66 palm and residues of the RNase H domain (Figures 4 and 6). The more extensive contacts between RT and RNA:DNA versus DNA:DNA may account for the increased polymerization activity and processivity of the enzyme with RNA templates. Figure 6.Molecular surface representation of HIV-1 RT showing the nucleic acid binding cleft and the RNase H primer grip. Residues colored in cyan or magenta are amino acids within 3.8 Å of the 2′-OH of RNA template nucleotides (magenta) or any other part of nucleic acid (cyan). The RNA template is shown as red ribbon and the DNA primer in blue ribbon. Minor groove widths proximal to the thumb area or at the RNase H active site are indicated (∼10 and ∼8 Å, respectively). The trajectory and minor groove width of a hypothetical RNA strand that can be cleaved efficiently by RNase H are shown in red. The RNase H primer grip region is shown in ball and stick representation in the figure inset. Download figure Download PowerPoint There is also an increased involvement of the p51 subunit in binding the RNA:DNA relative to the DNA:DNA template-primer. Although residues Lys395 and Glu396 of the p51 subunit interact with both the DNA:DNA and RNA:DNA duplexes (with Pri10-Ade and Pri11-Ade, Figure 4), residues Lys22 and Lys390 of p51 interact only with the RNA:DNA duplex (with the phosphates of Tem4-Gua and Tem16-Ade). Nucleic acid geometry The nucleic acid geometry was analyzed using CURVES (Lavery and Sklenar, 1988) and SCHNAP (Lu et al., 1997). Both programs yielded similar results. Despite the difference in the nature of the duplex (RNA:DNA versus DNA:DNA), the sequence (PPT versus PBS) and the length (31:29 versus 19:18), the overall conformations of these two nucleic acids are remarkably similar. Both have a bend of ∼40° with the helical curvature occurring smoothly over bp 5–9 from the polymerase active site (Jacobo-Molina et al., 1993; Ding et al., 1998) (Figure 7). This bend is a hallmark of nucleic acids bound to a variety of polymerases and is associated with a transition from A- to B-form geometry. Figure 7.Stereo view of structures of the nucleic acid template-primers in the RT–DNA:DNA (Ding et al., 1998) and RT–RNA:DNA complexes. The 19mer DNA and 31mer RNA templates are shown in yellow and magenta, respectively. The 18mer DNA and 29mer DNA primers are cyan and blue. Region I contains the 4 bp near the polymerase active site. Region II consists of the next 4 bp at the bend of the nucleic acid. The next 5 bp compose region III, followed by region IV that contains residues of the ‘unzipped’ part of PPT. Download figure Download PowerPoint The helical parameters of the RNA:DNA duplex bound to HIV-1 RT were compared with values for canonical A- and B-form DNA:DNA and A-form RNA:RNA duplexes and with other RNA:DNA hybrids (Table I). The values obtained for the RNA:DNA in complex with RT were averaged within four separate regions of the nucleic acid. Region I contains the 4 bp near the polymerase active site. Region II consists of the next 4 bp at the bend of the nucleic acid. Region III includes the next 5 bp, followed by region IV, which contains residues of the ‘unzipped’ portion of the PPT (see below). The parameters that define nucleic acid conformation (Table I) suggest that none of the four regions has canonical A- or B-type geometry. However, the geometry of region I is significantly closer to that of A-form than the other regions. Regions II–IV have a conformation closer to an intermediate between A- and B-form, consistent with the suggestion of Arnott et al. (1986) that RNA:DNA duplexes adopt ‘H-form’ geometry. The H-form conformation is characterized by values for the inclination of the base pairs with respect to the helical axis, the dislocation of the base pairs from the helix axis (Xdisp) and the helical rise, which are intermediate between those of canonical A- and B-form helices (Table I). NMR studies of RNA:DNA duplexes in solution showed that unliganded RNA:DNA duplexes adopt H-form geometry (Fedoroff et al., 1993; Lane et al., 1993). The width of the minor groove of the RNA:DNA (PPT) varies between canonical A- and B-forms (Figure 8), however, and it is closer to B-form in the stretch of rA:dTs (region IV, average minor groove width 7 Å). This is similar to the minor groove width in B-DNA (6 Å) determined by X-ray diffraction of DNA fibers (Chandrasekaran et al., 1989), and markedly lower than the average minor groove width in the RNA:DNA duplexes whose structures have been solved by NMR [∼9 Å, (Arnott et al., 1986; Fedoroff et al., 1993; Lane et al., 1993; Han et al., 1997)] or crystallography (8.7–10.5 Å) (Horton and Finzel, 1996), as shown in Figure 8. A purine-rich sequence with only two consecutive As (RNA:DNA 5′-GAAGAAGAA:CTTCTTCTT) had a considerably wider minor groove (9.4–10.1 Å) (Xiong and Sundaralingam, 1998), suggesting that the narrowing of the minor groove in 5′-oligo(rA): 3′-oligo(dT) tracts of RNA:DNA follows the same rules as in DNA:DNA [5′-oligo(dA):3′-oligo(dT) tracts], i.e. maximal narrowing of the minor groove requires at least four consecutive As. The narrow minor groove we report here for the rA:dT tract of the PPT is remarkably close to the minor groove narrowing predicted by Dickerson and coworkers (Han et al., 1997). Figure 8.Variation in minor groove width of the RNA:DNA template-primer. The four regions of nucleic acid are defined in the legend of Figure 7. The minor groove width values for canonical A- and B-type DNA are 11 and 6 Å, respectively. Download figure Download PowerPoint Table 1. Nucleic acid parameters Xdisp (Å) Inclination (°) Rise (Å) Twist (ω) Slide (Å) Region I (bp 1–4) −2.8 0.1 3.1 31.5 −0.1 Region II (bp 5–8) −2.5 −1.5 3.2 33.8 −0.1 Region III (bp 9–13) −2.3 −3.7 3.3 33.2 −0.2 Region IV (‘unzipped’ 14–19) −2.0 −3.9 3.2 32.2 0.1 RNA:DNAa −4.7 12.1 2.9 30.4 −1.6 RNA:DNAb −3.7 5.5 3.1 32.0 −1.9 RNA:DNAc −3.3 13.9 2.9 33.0 −1.2 RNA:DNAd 19 2.5 33.1 A-RNAe 13 2.8 32.7 −1.1 A-DNAf −4.1 12 2.9 31.1 −1.6 B-DNAf −0.14 −6 3.4 36.0 0.4 r(R10)d(Y10)g −3.3 6 2.9 33.7 r(R10)r(Y10)h −5.2 8.1 2.6 31 a Conn et al. (1999). b Fedoroff et al. (1997). c Horton and Finzel (1996). d Wang et al. (1982). e Leonard et al. (1994). f Dickerson (1992). g Gyi et al. (1996). h Gyi et al. (1998). The geometry of the RNA:DNA hybrid in complex with RT is considerably less uniform than the geometry of unliganded RNA:DNA duplexes, either in solution or in crystals. The variation in the width of the minor groove of the protein-bound RNA:DNA complex (up to 4.5 Å) (Figure 8) is considerably larger than that of free RNA:DNA hybrids (typically 0.5–2 Å), suggesting that the structure of the RNA:DNA duplex is significantly affected by the contacts with the enzyme. The effects of RT are manifested in several ways: (i) the RNA:DNA template-primer has a bend near the RT polymerase active site that is similar to the bend in complexes of RT and a DNA:DNA duplex; (ii) both the RNA:DNA (PPT) and DNA:DNA (PBS) duplexes have similar A-form geometry near the RT polymerase active site, where the majority of the protein–nucleic acid contacts occur; and (iii) there are structural irregularities (discussed below in more detail) in the RNA:DNA (PPT) that may be either caused or stabilized by specific contacts with the enzyme (Figure 4). Role of A-tracts in the structure of PPT A-tracts [in this case, stretches of four or more consecutive 5′-oligo(dA):3′-oligo(dT) (dA:dT) or 5′-oligo(rA): 3′-oligo(dT) (rA:dT)] have long been known to display several unusual features: they are straight (Han et al., 1997) and have a narrow minor groove and a large propeller twist, presumably because there are only two rather than three hydrogen bonds between the bases. A-tracts (dA:dT) are highly resistant to reconstitution around nucleosome cores (Rhodes, 1979) and interact poorly with TATA binding protein, which requires an ∼80° bend at the binding site (Kim et al., 1993). Integration host factor (IHF), a small protein that specifically recognizes an A-tract (dA:dT) by binding the phosphates of the narrow minor groove, appears to recognize an A-rich (dA:dT) DNA duplex by structure rather than by base-specific contacts (Rice et al., 1996). It is possible that special structural features of A-tracts (rA:dT) are recognized by HIV RT and affect the specificity of RNase H cleavage. While A-tracts in DNA (dA:dT) are unbent, bends are commonplace at junctions between A-tracts (dA:dT) and a dG:dC base pair (Dickerson et al., 1996). A dG:dC/dA:dT junction has been reported to be a flexible hinge, capable of adopting either a straight or a bent conformation under the influence of local forces (Dickerson et al., 1994). While this information is based primarily on crystallographic studies with DNA:DNA oligonucleotides, the same factors, i.e. large propeller twist and narrow minor groove, exist in an rA:dT RNA:DNA duplex (Table I). Therefore, the PPT sequence may have a natural propensity for (i) bending at the rG:dC/rA:dT junction and for (ii) 'stiffness’ in the stretches that contain multiple As. These two properties, combined with the extensive protein–nucleic acid interactions in this region (Figure 4; Table II), may contribute to an unusual structural deformation that we term ‘unzipping of the PPT’, which is centered at the rG:dC/rA:dT junction and is discussed below. Furthermore, they are likely to affect the trajectory of the template-primer and its positioning at the RNase H active site. Table 2. Template

A set of mutations [Ala-62-->Val(A62V), V75I, F77L, F116Y, and Q151M] in the polymerase domain of reverse transcriptase (RT) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) confers on the virus a reduced sensitivity to multiple antiretroviral dideoxynucleosides and has been seen in HIV-1 variants isolated from patients receiving combination chemotherapy with 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT) plus 2',3'-dideoxycytidine (ddC) or 2',3'-dideoxyinosine (ddI). The IC50 values of AZT, ddC, ddI, 2',3'-dideoxyguanosine, and 2',3'-didehydro-3'-deoxythymidine against an infectious clone constructed to include the five mutations were significantly higher than those of a wild-type infectious clone. The K1 value for AZT 5'-triphosphate determined for the virus-associated RT from a posttherapy strain was 35-fold higher than that of RT from a pretherapy strain. Detailed analysis of HIV-1 strains isolated at various times during therapy showed that the Q151M mutation developed first in vivo, at the time when the viremia level suddenly increased, followed by the F116Y and F77L mutations. All five mutations ultimately developed, and the viremia level rose even further. Analyses based on the three-dimensional structure of HIV-1 RT suggest that the positions where at least several of the five mutations occur are located in close proximity to the proposed dNTP-binding site of RT and the first nucleotide position of the single-stranded template.

The bacterial transcription initiation complex preorganizes promoter DNA for nucleotide binding and RNA synthesis.

Isocitrate dehydrogenases (IDHs) catalyze the oxidative decarboxylation of isocitrate to α-ketoglutarate, and regulation of the enzymatic activity of IDHs is crucial for their biological functions. Bacterial IDHs are reversibly regulated by phosphorylation of a strictly conserved serine residue at the active site. Eukaryotic NADP-dependent IDHs (NADP-IDHs) have been shown to have diverse important biological functions; however, their regulatory mechanism remains unclear. Structural studies of human cytosolic NADP-IDH (HcIDH) in complex with NADP and in complex with NADP, isocitrate, and Ca2+ reveal three biologically relevant conformational states of the enzyme that differ substantially in the structure of the active site and in the overall structure. A structural segment at the active site that forms a conserved α-helix in all known NADP-IDH structures assumes a loop conformation in the open, inactive form of HcIDH; a partially unraveled α-helix in the semi-open, intermediate form; and an α-helix in the closed, active form. The side chain of Asp279 of this segment occupies the isocitrate-binding site and forms hydrogen bonds with Ser94 (the equivalent of the phosphorylation site in bacterial IDHs) in the inactive form and chelates the metal ion in the active form. The structural data led us to propose a novel self-regulatory mechanism for HcIDH that mimics the phosphorylation mechanism used by the bacterial homologs, consistent with biochemical and biological data. This mechanism might be applicable to other eukaryotic NADP-IDHs. The results also provide insights into the recognition and specificity of substrate and cofactor by eukaryotic NADP-IDHs. Isocitrate dehydrogenases (IDHs) catalyze the oxidative decarboxylation of isocitrate to α-ketoglutarate, and regulation of the enzymatic activity of IDHs is crucial for their biological functions. Bacterial IDHs are reversibly regulated by phosphorylation of a strictly conserved serine residue at the active site. Eukaryotic NADP-dependent IDHs (NADP-IDHs) have been shown to have diverse important biological functions; however, their regulatory mechanism remains unclear. Structural studies of human cytosolic NADP-IDH (HcIDH) in complex with NADP and in complex with NADP, isocitrate, and Ca2+ reveal three biologically relevant conformational states of the enzyme that differ substantially in the structure of the active site and in the overall structure. A structural segment at the active site that forms a conserved α-helix in all known NADP-IDH structures assumes a loop conformation in the open, inactive form of HcIDH; a partially unraveled α-helix in the semi-open, intermediate form; and an α-helix in the closed, active form. The side chain of Asp279 of this segment occupies the isocitrate-binding site and forms hydrogen bonds with Ser94 (the equivalent of the phosphorylation site in bacterial IDHs) in the inactive form and chelates the metal ion in the active form. The structural data led us to propose a novel self-regulatory mechanism for HcIDH that mimics the phosphorylation mechanism used by the bacterial homologs, consistent with biochemical and biological data. This mechanism might be applicable to other eukaryotic NADP-IDHs. The results also provide insights into the recognition and specificity of substrate and cofactor by eukaryotic NADP-IDHs. Isocitrate dehydrogenases (IDHs) 1The abbreviations used are: IDH, isocitrate dehydrogenase; BsIDH, B. subtilis NADP-IDH; EcIDH, E. coli NADP-IDH; HcIDH, human cytosolic NADP-IDH; PmIDH, porcine mitochondrial NADP-IDH; IDH-K/P, IDH kinase/phosphatase; NADP-IDH, NADP-dependent IDH; RMSD, root mean square deviation; MES, 2-morpholinoethanesulfonic acid; NCS, noncrystallographic symmetry. comprise a family of enzymes that catalyze oxidative decarboxylation of isocitrate into α-ketoglutarate in the Krebs cycle. Regulation of the enzymatic activity of IDHs is crucial for their biological functions. Eukaryotic cells express two distinct classes of IDHs that utilize either NAD or NADP as their cofactors and serve diverse biological functions. NAD-dependent IDH is localized to the mitochondrial matrix and is well known for its central role for energy production in the Krebs cycle. NADP-dependent IDHs (NADP-IDHs, EC 1.1.1.42) are primarily located either in mitochondria (1Haselbeck R.J. McAlister-Henn L. J. Biol. Chem. 1993; 268: 12116-12122Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) or cytoplasm (2Jennings G.T. Sechi S. Stevenson P.M. Tuckey R.C. Parmelee D. McAlister-Henn L. J. Biol. Chem. 1994; 269: 23128-23134Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). In addition to their potential catabolic role in the Krebs cycle, both mitochondrial and cytosolic NADP-IDHs are shown to play an important role in cellular defense against oxidative damage as a source of NADPH (3Jo S.H. Son M.K. Koh H.J. Lee S.M. Song I.H. Kim Y.O. Lee Y.S. Jeong K.S. Kim W.B. Park J.W. Song B.J. Huh T.L. Huhe T.L. J. Biol. Chem. 2001; 276: 16168-16176Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (454) Google Scholar, 4Lee S.M. Koh H.J. Park D.C. Song B.J. Huh T.L. Park J.W. Free Radic. Biol. Med. 2002; 32: 1185-1196Crossref PubMed Scopus (344) Google Scholar, 5Kim S.Y. Park J.W. Free Radic. Res. 2003; 37: 309-316Crossref PubMed Scopus (47) Google Scholar). Moreover, all eukaryotic cytosolic IDHs contains a type 1 peroxisomal targeting sequence at their C terminus (6Nekrutenko A. Hillis D.M. Patton J.C. Bradley R.D. Baker R.J. Mol. Biol. Evol. 1998; 15: 1674-1684Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar) that is sufficient to direct proteins into peroxisomes (7Gould S.J. Collins C.S. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002; 3: 382-389Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar). Cytosolic IDHs have been found in peroxisomes of yeast, human, and rat liver cells and are shown to be required for the β-oxidation of unsaturated fatty acids as a provider of NADPH inside peroxisomes (8Henke B. Girzalsky W. Berteaux-Lecellier V. Erdmann R. J. Biol. Chem. 1998; 273: 3702-3711Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (81) Google Scholar, 9van Roermund C.W. Hettema E.H. Kal A.J. van den Berg M. Tabak H.F. Wanders R.J. EMBO J. 1998; 17: 677-687Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar, 10Geisbrecht B.V. Gould S.J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 30527-30533Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (151) Google Scholar, 11Minard K.I. McAlister-Henn L. J. Biol. Chem. 1999; 274: 3402-3406Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (58) Google Scholar, 12Yoshihara T. Hamamoto T. Munakata R. Tajiri R. Ohsumi M. Yokota S. J. Histochem. Cytochem. 2001; 49: 1123-1131Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar). In contrast, Escherichia coli as well as other bacterial cells contain only a single NADP-IDH (EcIDH) whose structures and functions have been studied extensively (13Hurley J.H. Thorsness P.E. Ramalingam V. Helmers N.H. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 8635-8639Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar, 14Hurley J.H. Dean A.M. Sohl J.L. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Science. 1990; 249: 1012-1016Crossref PubMed Scopus (210) Google Scholar, 15Stoddard B.L. Dean A. Koshland Jr., D.E. Biochemistry. 1993; 32: 9310-9316Crossref PubMed Scopus (113) Google Scholar, 16Finer-Moore J. Tsutakawa S.E. Cherbavaz D.R. LaPorte D.C. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Biochemistry. 1997; 36: 13890-13896Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar, 17Mesecar A.D. Stoddard B.L. Koshland Jr., D.E. Science. 1997; 277: 202-206Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar). EcIDH functions at a critical juncture between the Krebs cycle and the glyoxylate cycle, and regulation of its activity controls the substrate flux between the two reactions (18LaPorte D.C. J. Cell. Biochem. 1993; 51: 14-18Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). The activity of EcIDH is regulated by the phosphorylation of Ser113, which is located at the isocitrate-metal ion-binding site (13Hurley J.H. Thorsness P.E. Ramalingam V. Helmers N.H. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 8635-8639Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar, 14Hurley J.H. Dean A.M. Sohl J.L. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Science. 1990; 249: 1012-1016Crossref PubMed Scopus (210) Google Scholar, 16Finer-Moore J. Tsutakawa S.E. Cherbavaz D.R. LaPorte D.C. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Biochemistry. 1997; 36: 13890-13896Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar, 19Dean A.M. Koshland D.E.J. Science. 1990; 249: 1044-1046Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). The phosphorylation reaction is reversibly catalyzed by a bifunctional enzyme, IDH kinase/phosphatase (IDH-K/P) (18LaPorte D.C. J. Cell. Biochem. 1993; 51: 14-18Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). This regulatory mechanism has been proposed to apply to Bacillus subtilis NADP-IDH (BsIDH), which exhibits extensive sequence and structural similarities with EcIDH (20Singh S.K. Matsuno K. LaPorte D.C. Banaszak L.J. J. Biol. Chem. 2001; 276: 26154-26163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (49) Google Scholar, 21Singh S.K. Miller S.P. Dean A. Banaszak L.J. LaPorte D.C. J. Biol. Chem. 2002; 277: 7567-7573Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (28) Google Scholar). The regulatory mechanism of mammalian NADP-IDHs is still unclear. Although mammalian and bacterial NADP-IDHs share less than 20% sequence identity, the structure of porcine heart mitochondrial NADP-IDH (PmIDH) shows an overall structure very similar to its bacterial counterparts (22Ceccarelli C. Grodsky N.B. Ariyaratne N. Colman R.F. Bahnson B.J. J. Biol. Chem. 2002; 277: 43454-43462Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (95) Google Scholar). Structure-based sequence alignments indicate that mammalian NADP-IDHs have a strictly conserved serine at a position equivalent to Ser113 of EcIDH (6Nekrutenko A. Hillis D.M. Patton J.C. Bradley R.D. Baker R.J. Mol. Biol. Evol. 1998; 15: 1674-1684Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar, 22Ceccarelli C. Grodsky N.B. Ariyaratne N. Colman R.F. Bahnson B.J. J. Biol. Chem. 2002; 277: 43454-43462Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (95) Google Scholar). Those results led to the suggestion that mammalian NADP-IDHs might also contain a phosphorylation site and are possibly regulated by kinases and phosphatases like their bacterial homologs (22Ceccarelli C. Grodsky N.B. Ariyaratne N. Colman R.F. Bahnson B.J. J. Biol. Chem. 2002; 277: 43454-43462Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (95) Google Scholar). We report here the crystal structures of human cytosolic NADP-IDH (HcIDH) in complex with its cofactor, NADP (designated as binary complex thereafter), and in complex with NADP, the substrate isocitrate, and Ca2+ (designated as quaternary complex thereafter). Structural comparisons of HcIDH with other NADP-IDHs reveal that HcIDH is likely to utilize a unique mechanism to self-regulate its activity that mimics the phosphorylation mechanism used by its bacterial homologs. The structural data also provide insights into the recognition and specificity of substrate and cofactor by eukaryotic NADP-IDHs. Protein Expression and Purification—The plasmid pET-22b(+) containing the recombinant HcIDH gene fused with a His6 tag at the C terminus was expressed in the E. coli BL21(DE3) strain. E. coli cells transformed with the vector were grown overnight at 37 °C in 100 ml of LB media containing ampicillin (0.1 mg/ml). The overnight culture was used to inoculate 2 liters of LB medium and grown to an A600 nm of 0.6. After 12 h of expression induced with 1 mm isopropyl-β-d-thiogalacto-pyranoside at 20 °C, the cells were collected by centrifugation at 4,000 × g and suspended in 40 ml of lysis buffer containing 20 mm Tris·HCl, pH 7.4, 1%Triton X-100, 500 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoethanol, and 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride. The cells were lysed on ice by sonication, and cell debris was precipitated by centrifugation at 15,000 × g. HcIDH was purified by affinity chromatography using a nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column (Qiagen). The lysis extract was first loaded on the column and then washed with a washing buffer (20 mm Tris·HCl, pH 7.4, 30 mm imidazole, and 500 mm NaCl) to elute nonspecific binding proteins. The target protein was eluted finally with an elution buffer (20 mm Tris·HCl, pH 7.4, 200 mm imidazole, and 500 mm NaCl). The protein was concentrated to ∼15 mg/ml in a storage buffer (20 mm Tris·HCl, pH 7.4, and 100 mm NaCl). HcIDH consists of 414 amino acids with a calculated molecular mass of 46.7 kDa. Dynamic light scattering and gel filtration analyses indicate that the protein is homogeneously dispersed and forms a homodimer in solution in both the presence and absence of substrate (data not shown). Biochemical assays indicate that the enzyme is active with a Michaelis constant (Km) of 12.4 μm and a maximum velocity of 41.9 μmol/min/mg. Enzymatic Activity Assay—The IDH activity of HcIDH was assayed spectrophotometrically by measuring the reduction of NADP to NADPH, which has an extinction coefficient of 6220 m-1·cm-1 at 340 nm. The standard reaction buffer (1 ml) consists of 20 mm Tris·HCl, pH 7.4, 0.1 mm NADP, 4 mmdl-isocitrate, and 2 mm MnSO4. The reaction was initiated by the addition of 20 μl of HcIDH at a concentration of 0.05 mg/ml or its appropriate dilution. The reaction rate was calculated as ΔA340/min. Crystallization and Diffraction Data Collection—Crystallization was conducted using the hanging drop vapor diffusion method. Crystals of the HcIDH-NADP complex were grown at 4 °C in a drop with equal volumes of the protein solution containing 15 mg/ml HcIDH in the storage buffer and the reservoir solution (100 mm MES, pH 6.5, and 12% polyethylene glycol 20,000). Crystals of the HcIDH-NADP-isocitrate-Ca2+ complex were grown at 20 °C in a drop with equal volumes of the protein solution containing 15 mg/ml HcIDH, 10 mmdl-isocitrate, 10 mm CaCl2, and 10 mm NADP and the reservoir solution containing 100 mm MES, pH 5.9, and 20% polyethylene glycol 6,000. The diffraction data for the binary complex were collected from a flash-cooled crystal at 100 K using the F2 beamline at the Cornell High Energy Synchrotron Source with a wavelength of 0.9791 Å and were processed, integrated, and scaled together with HKL2000 (23Otwinowski Z. Minor W. Methods Enzymol. 1997; 276: 307-326Crossref PubMed Scopus (38573) Google Scholar). Diffraction data for the quaternary complex were collected from a flash-cooled crystal at 100 K using an in-house Rigaku R-Axis IV++ and CuKα radiation (wavelength of 1.5418 Å) and were processed and scaled together using CrystalClear (24Pflugrath J.W. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 1999; 55: 1718-1725Crossref PubMed Scopus (1417) Google Scholar). The diffraction data statistics are summarized in Table I.Table IX-ray diffraction data and refinement statisticsBinary complexQuaternary complexDiffraction data statisticsResolution (Å)40.00-2.70 (2.75-2.70)aThe numbers in parentheses refer to the highest resolution shell12.00-2.41 (2.50-2.41)Space groupP43212P21a, b, and c (Å)82.7, 82.7, 308.0103.3, 86.7, 115.8β (°)107.2Completeness (%)99.8 (99.8)95.7 (95.7)Rmerge (%)bRmerge = ΣhklΣi|Ii(hkl)i - 〈I(hkl)〉|/ΣhklΣiIi(hkl)10.3 (38.6)8.5 (8.5)Observed reflections275,630224,244Unique reflections30,44571,234〈I/σ(I)〉10.2 (6.3)7.8 (2.9)Redundancy9.1 (7.5)3.1 (2.9)Mosaicity0.270.50Refinement statisticsTotal reflections30,39370,684Working set28,86467,062Free R set1,5293,622Subunits/asymmetric unit24Total protein atoms6,55613,124Total ligand atoms96248Total solvent atoms154914Average B factor (Å2)36.322.7Residues 271-28662.1 (A), 101.8 (B)15.5NADP32.9 (A), 27.9 (B)15.8Isocitrate34.6R factorcR factor = ∥Fo‖ - |Fc∥/|Fo|0.2100.214Free R factorcR factor = ∥Fo‖ - |Fc∥/|Fo|0.2700.253RMSD from ideal geometryBonds (Å)0.0070.006Angles (°)1.301.29Ramachandran plotCore (%)87.290.2Allowed (%)12.49.1Generously allowed (%)0.40.7Luzzati atomic positional error0.320.29a The numbers in parentheses refer to the highest resolution shellb Rmerge = ΣhklΣi|Ii(hkl)i - 〈I(hkl)〉|/ΣhklΣiIi(hkl)c R factor = ∥Fo‖ - |Fc∥/|Fo| Open table in a new tab Structure Determination—The structure of the HcIDH binary complex was solved with the molecular replacement method as implemented in CNS (25Brunger A.T. Adams P.D. Clore G.M. Delano W.L. Gros P. Grosse-Kunstleve R.W. Jiang J.-S. Kuszewski J. Nilges M. Pannu N.S. Read R.J. Rice L.M. Simonson T. Warren G.L. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 1998; 54: 905-921Crossref PubMed Scopus (16967) Google Scholar) using the crystal structure of PmIDH (22Ceccarelli C. Grodsky N.B. Ariyaratne N. Colman R.F. Bahnson B.J. J. Biol. Chem. 2002; 277: 43454-43462Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (95) Google Scholar) as the search model. Cross-rotation function search and subsequent translation function search using the monomeric PmIDH produced two outstanding peaks, corresponding to two HcIDH monomers in the asymmetric unit. Structure refinement was carried out using CNS. Model building was performed with O (26Jones T.A. Zou J.Y. Cowan S.W. Kjeldgaard M. Acta Crystallogr. Sect. A. 1991; 47: 110-119Crossref PubMed Scopus (13011) Google Scholar). The free R factor was calculated with 5% of the data, and a bulk solvent correction was applied in all refinements. Strict 2-fold noncrystallographic symmetry (NCS) constraints were used in the early stage of refinement, but the two monomers in the asymmetric unit were refined independently in the later stage of refinement because of the conformational differences. In the initial difference Fourier maps there was strong residual electron density at the active site of each monomer, and the position and shape of the electron density match NADP very well. Because HcIDH is an NADP-IDH, we modeled this piece of electron density as NADP. Because no NADP was added during the purification process and in the crystallization solution, the bound NADP must have copurified together with the enzyme from the expression system. Electron density peaks in difference Fourier maps at a height of above 2.5 σ were assigned as water molecules if they had reasonable geometry in relation to hydrogen bond donors or acceptors from amino acids or other water molecules, and their B factors did not rise above 60 Å2 during subsequent refinement. The structure of the HcIDH quaternary complex was also solved with the molecular replacement method. We employed the monomeric and dimeric PmIDH and the monomeric and dimeric HcIDH-NADP complex as the search models, respectively. The dimeric PmIDH model produced the best results, which revealed two clear and outstanding solutions in cross-rotation function and translation function searches, corresponding to two HcIDH homodimers related by a pseudo 2-fold NCS in the asymmetric unit. Application of strict 4-fold NCS constraints could not decrease both the R and free R factors to below 30%. Therefore, NCS restraints were applied in the final stage of refinement. NADP, isocitrate, and Ca2+ at the active site have well defined electron density in the initial difference Fourier maps and were included in the refinement after the R factor was reduced to 26.5%. Water molecules were added gradually in the model, and refinement was based on the criteria described above. Overall Structures of HcIDH—The structure of the binary complex contains two HcIDH molecules in an asymmetric unit that forms an asymmetric homodimer. The final structure model contains two full HcIDH polypeptide chains each consisting of residues 1–414, two NADP molecules, and 154 water molecules. The region consisting of residues 271–286 in subunit A has well defined electron density (Fig. 1A), whereas its counterpart in subunit B is partially disordered and has discontinuous electron density. The structure of the quaternary complex contains four HcIDH molecules per asymmetric unit that form two homodimers related by a pseudo 2-fold NCS. The final structure model contains four full-length HcIDH molecules, four NADP molecules, four isocitrate molecules, four Ca2+ ions, and 914 water molecules. The region consisting of residues 271–286 in all four subunits of the quaternary complex is well ordered and has good electron density (Fig. 1B). A summary of the structure refinement and the final model statistics is given in Table I. The HcIDH monomer has a secondary structure fold and topology similar to other dimeric NADP-IDHs whose structures are known, specifically EcIDH (13Hurley J.H. Thorsness P.E. Ramalingam V. Helmers N.H. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 8635-8639Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar, 14Hurley J.H. Dean A.M. Sohl J.L. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Science. 1990; 249: 1012-1016Crossref PubMed Scopus (210) Google Scholar), BsIDH (20Singh S.K. Matsuno K. LaPorte D.C. Banaszak L.J. J. Biol. Chem. 2001; 276: 26154-26163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (49) Google Scholar), and PmIDH (22Ceccarelli C. Grodsky N.B. Ariyaratne N. Colman R.F. Bahnson B.J. J. Biol. Chem. 2002; 277: 43454-43462Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (95) Google Scholar), even though these enzymes share varying sequence identity (∼16–17% between mammalian and bacterial NADP-IDHs and ∼69% between HcIDH and PmIDH) (Figs. 2 and 3). Like other NADP-IDHs, HcIDH consists of three domains: a large domain, a small domain, and a clasp domain. The large domain comprises residues 1–103 and 286–414 and has a typical Rossmann fold. The small domain contains residues 104–136 and 186–285 and forms an α/β sandwich structure. The clasp domain ranges from residues 137 to 185 and folds as two two-stranded anti-parallel β-sheets stacked on each other.Fig. 3Structure-based sequence alignment of HcIDH with other NADP-IDHs. The structures used in comparisons are PmIDH, EcIDH, and BsIDH. Invariant residues are highlighted as shaded red boxes, and conserved residues are indicated by open red boxes. The secondary structure of HcIDH in the quaternary complex is placed above the alignment. The alignment was drawn with ESPript (35Gouet P. Courcelle E. Stuart D.I. Metoz F. Bioinformatics. 1999; 15: 305-308Crossref PubMed Scopus (2530) Google Scholar).View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) The large and small domains are joined together by a β-sheet (Fig. 2). There are two clefts flanked on each side of the β-sheet. The large, deep cleft is formed by the large and small domains of one subunit and the small domain of the adjacent subunit and comprises the active site (Fig. 2). The active site cleft is hydrophilic in nature and is exposed to solvent and accessible to substrate and/or cofactor. It consists of the NADP-binding site and the isocitrate-metal ion-binding site. The small, shallow cleft is formed between the large and small domains of the same subunit and is located at the back of the large cleft (designated as the back cleft) (Fig. 2). In contrast to bacterial IDHs in which the back cleft is largely hydrophobic (13Hurley J.H. Thorsness P.E. Ramalingam V. Helmers N.H. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 8635-8639Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar, 20Singh S.K. Matsuno K. LaPorte D.C. Banaszak L.J. J. Biol. Chem. 2001; 276: 26154-26163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (49) Google Scholar), the small cleft in HcIDH is hydrophobic at the base and highly hydrophilic at the rim. This feature is also observed in PmIDH. The back cleft has been proposed to have functional importance (13Hurley J.H. Thorsness P.E. Ramalingam V. Helmers N.H. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 8635-8639Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar). Our results suggest that the back cleft is involved in the regulation of conformational changes of HcIDH and may affect the function of the enzyme (see discussion later). The clasp domain functions as an interlock in all dimeric NADP-IDH structures that holds the two subunits together to form the catalytic active site (Fig. 2). Structural and sequence comparisons indicate that the clasp domain varies substantially in primary sequence and differs in three-dimensional structure among NADP-IDHs from different species (Figs. 2 and 3). In both HcIDH and PmIDH structures, the clasp domains of the two subunits in the homodimer interwind together to form two layers of four-stranded anti-parallel β-sheets. However, the clasp domains of the bacterial enzymes form two anti-parallel α-helices and a four-stranded anti-parallel β-sheet (13Hurley J.H. Thorsness P.E. Ramalingam V. Helmers N.H. Koshland Jr., D.E. Stroud R.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 8635-8639Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar, 20Singh S.K. Matsuno K. LaPorte D.C. Banaszak L.J. J. Biol. Chem. 2001; 276: 26154-26163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (49) Google Scholar). These differences can serve as indicators for phylogenetic and evolutionary analyses. Like other dimeric NADP-IDHs, HcIDH exists as a homodimer in solution in both the absence and the presence of substrate determined by dynamic light scattering and gel filtration analyses (data not shown) and forms a homodimer in the crystal structures. Similar to EcIDH, BsIDH, and PmIDH, the dimeric HcIDH has two active sites, each composed of amino acid residues from both subunits of the homodimer (see discussion later), suggesting that HcIDH most likely functions as a homodimer. The intersubunit relationship and interface contacts in the HcIDH quaternary complex are similar to those in the structures of EcIDH, BsIDH, and PmIDH. Dimerization is mediated by extensive hydrophobic and hydrophilic interactions primarily between the two clasp domains and between four α-helices of the small domains (α9 and α10 of each subunit) (Figs. 2 and 3). The dimer interface buries 3703 Å2 solvent-accessible surface of each monomer, corresponding to 18.5% of the surface area of the monomer. The buried surface area in EcIDH, BsIDH, and PmIDH is 3278 Å2 (17.3%), 3610 Å2 (18.5%), and 3404 Å2 (17.7%), respectively. The large buried surface area in the dimer interface suggests that these dimeric enzymes are very stable. However, in the HcIDH binary complex the two subunits of the homodimer adopt different conformations. Helix α10 of the small domain is completely unwound and intrudes into the active site in subunit A; in subunit B it is partially unwound and is extended into subunit A. Helix α9 in both subunits is expanded outwards (Figs. 2 and 3). The dimer interface buries 2867 Å2 solvent-accessible surface of each monomer, corresponding to ∼13.8% of the surface area of the monomer. Compared with the quaternary complex, the dimer interface in the binary complex is less compact and probably less stable. Isocitrate-Metal Ion-binding Site—In the structure of the HcIDH quaternary complex, an isocitrate molecule and a Ca2+ ion are found to bind at the active site of each subunit. The isocitrate substrate interacts with Thr77, Ser94, Arg100, Arg109, Arg132, Tyr139, and Asp275 of one subunit; Lys212, Thr214, and Asp252 of the adjacent subunit; 3 water molecules; NADP; and Ca2+. Most of these residues are strictly conserved in all NADP-IDHs, except Thr214, which is invariant in eukaryotic NADP-IDHs but is replaced with an Asn in bacterial enzymes. The α-carboxylate of isocitrate forms hydrophilic interactions with the side chains of Arg100, Arg109, Arg132, and Asp275 and the carbonyl group of the nicotinamide moiety of NADP. Its hydroxyl group makes hydrogen bonding interactions with the side chain of Asp275 and the side chains of Lys212 and Asp252 of the adjacent subunit. The β-carboxylate group has hydrophilic interactions with the side chains of Arg100, Arg132, Tyr139, and Asp275, and the side chain of Lys212 of the adjacent subunit. The γ-carboxylate group forms hydrogen bonds with the side chains of Thr77 and Ser94, the side chain of Thr214 of the adjacent subunit, and the 2′-OH group of the nicotinamide ribose of NADP. In addition, one α-carboxylate oxygen and the hydroxyl group of isocitrate chelate the Ca2+ ion. NADP-IDHs require a divalent metal ion, usually Mn2+ or Mg2+, for their enzymatic activity. In all structures of NADP-IDHs bound with a divalent metal ion, the residues involved in chelating the metal ion are strictly conserved. Substitution of Ca2+ for Mg2+ has very little effect on the structure of the active site with only slight changes of the coordination geometry of the metal ion in EcIDH. This substitution decreases drastically the enzymatic rate of EcIDH but does not significantly change the relative binding affinities of the substrate and the metal ion (15Stoddard B.L. Dean A. Koshland Jr., D.E. Biochemistry. 1993; 32: 9310-9316Crossref PubMed Scopus (113) Google Scholar, 17Mesecar A.D. Stoddard B.L. Koshland Jr., D.E. Science. 1997; 277: 202-206Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar). In protein structures Mn2+ and Mg2+ prefer to have six ligands, and Ca2+ prefers to have seven or eight ligands (27Glusker J.P. Adv. Prot. Chem. 1991; 42: 1-76Crossref PubMed Google Scholar). In our HcIDH quaternary complex, Ca2+ is coordinated by one α-carboxylate oxygen and the hydroxyl group of isocitrate, the main chain carbonyl oxygen, and the side chain Oδ-1 atom of Asp275, the side chain Oδ-1 atom (and possibly Oδ-2 atom) of Asp279, the side chain Oδ-2 atom of Asp252 of the adjacent subunit, and one water molecule and adopts a distorted pentagonal bipyramid coordination geometry. This geometry is similar to that observed in the Ca2+-bound EcIDH structure but slightly different from the ideal octahedral geometry obse

A new type of higher plant alkaloid, 1,6,7,8-tetrahydroxyoctahydroindolizine, designated castanospermine, has been isolated from the toxic seeds of the Australian legume Castanospermum australe.