ABSTRACT Recently, efficient and long-term in vivo gene transfer by recombinant adeno-associated virus type 2 (rAAV) vectors has been demonstrated in a variety of tissues. Further improvement in vector titer and purity will expedite this in vivo exploration and provide preclinical information required for use in human gene therapy. In an effort to obtain higher titers, we constructed a novel AAV helper plasmid which utilizes translational control of AAV Rep genes (J. Li et al., J. Virol. 71:5236–5243, 1997). To address the issue of purity, in this study we report the first rAAV production method which is completely free of adenovirus (Ad) helper virus. The new production system uses a plasmid construct which contains a mini-Ad genome capable of propagating rAAV in the presence of AAV Rep and Cap genes. This construct is missing some of the early and most of the late Ad genes and is incapable of producing infectious Ad. Transfection of 293 cells with the new mini-Ad helper and AAV packaging plasmids results in high-titer rAAV vectors with yields greater than 1,000 transducing units, or 10 5 viral particles per cell. When rAAV vectors were produced by using this production scheme and compared to traditional heat-inactivated rAAV preparations in vitro and in vivo, we observed transduction equivalent to or better than normal levels. The complete removal of infectious Ad from AAV production should facilitate a better understanding of immune response to AAV vectors in vivo, eliminate the need for developing replication-competent Ad assays, and provide a more defined reagent for clinical use.

ABSTRACT The serotypes of adeno-associated virus (AAV) have the potential to become important resources for clinical gene therapy. In an effort to compare the role of serotype-specific virion shells on vector transduction, we cloned each of the serotype capsid coding domains into a common vector backbone containing AAV type 2 replication genes. This strategy allowed the packaging of AAV2 inverted terminal repeat vectors into each serotype-specific virions. Each of these helper plasmids (pXR1 through pXR5) efficiently replicated the transgene DNA and expressed helper proteins at nearly equivalent levels. In this study, we observed a correlation between the amount of transgene replication and packaging efficiency. The physical titer of these hybrid vectors ranged between 1.3 × 10 11 and 9.8 × 10 12 /ml (types 1 and 2, respectively). Of the five serotype vectors, only types 2 and 3 were efficiently purified by heparin-Sepharose column chromatography, illustrating the high degree of similarity between these virions. We analyzed vector transduction in reference and mutant Chinese hamster ovary cells deficient in heparan sulfate proteoglycan and saw a correlation between transduction and heparan sulfate binding data. In this analysis, types 1 and 5 were most consistent in transduction efficiency across all cell lines tested. In vivo each serotype was ranked after comparison of transgene levels by using different routes of injection and strains of rodents. Overall, in this analysis, type 1 was superior for efficient transduction of liver and muscle, followed in order by types 5, 3, 2, and 4. Surprisingly, this order changed when vector was introduced into rat retina. Types 5 and 4 were most efficient, followed by type 1. These data established a hierarchy for efficient serotype-specific vector transduction depending on the target tissue. These data also strongly support the need for extending these analyses to additional animal models and human tissue. The development of these helper plasmids should facilitate direct comparisons of serotypes, as well as begin the standardization of production for further clinical development.

The genetic diversity of Yersinia pestis , the etiologic agent of plague, is extremely limited because of its recent origin coupled with a slow clock rate. Here we identified 2,326 SNPs from 133 genomes of Y. pestis strains that were isolated in China and elsewhere. These SNPs define the genealogy of Y. pestis since its most recent common ancestor. All but 28 of these SNPs represented mutations that happened only once within the genealogy, and they were distributed essentially at random among individual genes. Only seven genes contained a significant excess of nonsynonymous SNP, suggesting that the fixation of SNPs mainly arises via neutral processes, such as genetic drift, rather than Darwinian selection. However, the rate of fixation varies dramatically over the genealogy: the number of SNPs accumulated by different lineages was highly variable and the genealogy contains multiple polytomies, one of which resulted in four branches near the time of the Black Death. We suggest that demographic changes can affect the speed of evolution in epidemic pathogens even in the absence of natural selection, and hypothesize that neutral SNPs are fixed rapidly during intermittent epidemics and outbreaks.

Efficient and widespread gene transfer is required for successful treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD). Here, we performed the first clinical trial using a chimeric adeno-associated virus (AAV) capsid variant (designated AAV2.5) derived from a rational design strategy. AAV2.5 was generated from the AAV2 capsid with five mutations from AAV1. The novel chimeric vector combines the improved muscle transduction capacity of AAV1 with reduced antigenic crossreactivity against both parental serotypes, while keeping the AAV2 receptor binding. In a randomized double-blind placebo-controlled phase I clinical study in DMD boys, AAV2.5 vector was injected into the bicep muscle in one arm, with saline control in the contralateral arm. A subset of patients received AAV empty capsid instead of saline in an effort to distinguish an immune response to vector versus minidystrophin transgene. Recombinant AAV genomes were detected in all patients with up to 2.56 vector copies per diploid genome. There was no cellular immune response to AAV2.5 capsid. This trial established that rationally designed AAV2.5 vector was safe and well tolerated, lays the foundation of customizing AAV vectors that best suit the clinical objective (e.g., limb infusion gene delivery) and should usher in the next generation of viral delivery systems for human gene transfer.

Abstract Prime editing (PE) has advantages for small insertion, deletion or point mutations without double-stranded DNA breaks. The 3’-extension of pegRNAs could negatively affect its stability or folding and comprise the PE activity. Here we generated s tem-loop PEs (sPEs) by adding stem-loop aptamers at the 3’-terminal of pegRNA, which can be tethered to Cas9 nickase resulting in tethered PEs (tPEs). sPEs and tPEs increased the small insertion, deletion or point mutations efficiency by 2-4-fold on average in HEK293, U2OS and HeLa cells. We split the modified pegRNAs into sgRNA and prime RNA. The resulting s plit pegR N A prime editors (SnPEs) maintain the PE activity and increase flexibility.

Epigenetic modifications play an essential role in chromatin architecture and dynamics. The role of epigenetic modification in chromatin organization has been studied by Hi-C from population cells, but imaging techniques to study their correlation and regulation in single living cells are lacking. Here we develop a CRISPR-based EpiGo (Epigenetic perturbation induced Genome organization) system to track epigenetic modification-mediated relocation, interaction or reorganization of genomic regions in living cells. EpiGo-KRAB is sufficient to induce the relocation of genomic loci to HP1alpha; condensates and trigger genomic interactions. EpiGo-KRAB also triggers the induction of H3K9me3 at large genomic regions, which decorate on the surface of HP1alpha; condensates possibly driven by phase separation.

Abstract Despite the long-observed correlation between H3K9me3, chromatin architecture and transcriptional repression, how H3K9me3 regulates genome higher-order organization and transcriptional activity in living cells remains unclear. Here we develop EpiGo ( E pigenetic p erturbation i nduced G enome o rganization)-KRAB to introduce H3K9me3 at hundreds of loci spanning megabases on human chromosome 19 and simultaneously track genome organization. EpiGo-KRAB is sufficient to induce de novo heterochromatin-like domain formation, which requires SETDB1, a methyltransferase of H3K9me3. Unexpectedly, EpiGo-KRAB induced heterochromatin-like domain does not result in widespread gene repression except a small set of genes with concurrent loss of H3K4me3 and H3K27ac. Ectopic H3K9me3 appears to spread in inactive regions but is largely restricted to transcriptional initiation sites in active regions. Finally, Hi-C analysis showed that EpiGo-KRAB induced to reshape existing compartments. These results reveal the role of H3K9me3 in genome organization could be partially separated from its function in gene repression.

Abundant and diverse domestic mammals living on the Tibetan Plateau provide useful materials for investigating adaptive evolution and genetic convergence. Here, we utilized 327 genomes from horses, sheep, goats, cattle, pigs and dogs living at both high and low altitudes, including 73 genomes generated for this study, to disentangle the genetic mechanisms underlying local adaptation of domestic mammals. Although molecular convergence is comparatively rare at the DNA sequence level, we found convergent signature of positive selection at the gene level, particularly EPAS1 gene in these Tibetan domestic mammals. We also reported a potential function in response to hypoxia for the gene C10orf67, which underwent positive selection in three of the domestic mammals. Our data provides insight into adaptive evolution of high-altitude domestic mammals, and should facilitate the search for additional novel genes involved in the hypoxia response pathway.