ABSTRACT Cystic fibrosis (CF) is caused by mutations in a chloride channel called the human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (hCFTR). We used cryo-EM global conformational ensemble reconstruction to characterize the mechanism by which the breakthrough drug VX445 (Elexacaftor) simultaneously corrects both protein-folding and channel-gating defects caused by CF mutations. VX445 drives hCFTR molecules harboring the gating-defective G551D mutation towards the open-channel conformation by binding to a site in the first transmembrane domain. This binding interaction reverses the usual pathway of allosteric structural communication by which ATP binding activates channel conductance, which is blocked by the G551D mutation. Our ensemble reconstructions include a 3.4 Å non-native structure demonstrating that detachment of the first nucleotide-binding domain of hCFTR is directly coupled to local unfolding of the VX445 binding site. Reversal of this unfolding transition likely contributes to its corrector activity by cooperatively stabilizing NBD1 and the transmembrane domains of hCFTR during biogenesis. Summary Cryo-EM global conformational ensemble reconstruction has been used to characterize the mechanism-of-action of a breakthrough pharmaceutical that corrects fatal protein-folding and channel-gating defects in the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).

Abstract Multiple paralogous ABCF ATPases are encoded in most genomes, but the physiological functions remain unknown for most of them. We herein compare the four Escherichia coli K12 ABCFs – EttA, Uup, YbiT, and YheS – using assays previously employed to demonstrate EttA gates the first step of polypeptide elongation on the ribosome dependent on ATP/ADP ratio. A Δ uup knockout, like Δ ettA , exhibits strongly reduced fitness when growth is restarted from long-term stationary phase, but neither Δ ybiT nor Δ yheS exhibits this phenotype. All four proteins nonetheless functionally interact with ribosomes based on in vitro translation and single-molecule fluorescence resonance energy transfer experiments employing variants harboring glutamate-to-glutamine active-site mutations (EQ 2 ) that trap them in the ATP-bound conformation. These variants all strongly stabilize the same global conformational state of a ribosomal elongation complex harboring deacylated tRNA Val in the P site. However, EQ 2 -Uup uniquely exchanges on/off the ribosome on a second timescale, while EQ 2 -YheS-bound ribosomes uniquely sample alternative global conformations. At sub-micromolar concentrations, EQ 2 -EttA and EQ 2 -YbiT fully inhibit in vitro translation of an mRNA encoding luciferase, while EQ 2 -Uup and EQ 2 -YheS only partially inhibit it at ~10-fold higher concentrations. Moreover, tripeptide synthesis reactions are not inhibited by EQ 2 -Uup or EQ 2 -YheS, while EQ 2 -YbiT inhibits synthesis of both peptide bonds and EQ 2 -EttA specifically traps ribosomes after synthesis of the first peptide bond. These results support the four E. coli ABCF paralogs all having different activities on translating ribosomes, and they suggest that there remains a substantial amount of functionally uncharacterized “dark matter” involved in mRNA translation.

The genomes of most mesophilic organisms encode multiple A TP- B inding C assette F (ABCF) proteins. EttA, one of four E. coli paralogs, regulates synthesis of the first peptide bond on the ribosome dependent on ATP/ADP ratio, while A ntibiotic Re sistance factors (AREs), paralogs in other organisms, both regulate and directly mediate resistance to ribosome-targeted antibiotics. However, the physiological functions remain unclear for most paralogs, and the mechanism-of-action has yet to be rigorously established for any paralog. We herein present single particle cryogenic electron microscopy structures of ribosome complexes of all four E. coli ABCF paralogs (EttA, Uup, YbiT, and YheS), which, together with previously determined ARE structures, show that ABCFs control the binding geometry of the tRNA in the peptidyl-tRNA-binding (P) site on the ribosome. They modulate the position of its acceptor stem relative to the peptidyl transferase center (PTC) in a manner that can either promote (EttA and Uup) or disrupt (YbiT, YheS, and the AREs) proper catalytic geometry. The YbiT/70S reconstructions include a conformation with no density for ribosomal protein bL33, and structural analyses support the exchange of this sub-stoichiometric ribosomal protein being functionally related to conformational changes in YbiT controlled by sequence variations in the strongly non-canonical Signature Sequence in its first ABC domain. Our studies establish general structural/enzymological principles by which the ATPase activity of ABCF proteins controls translation elongation coupled to modulation of conformation and stereochemistry in the catalytic core of the ribosome.

Structural genomics consortia established that protein crystallization is the primary obstacle to structure determination using x-ray crystallography. We previously demonstrated that crystallization propensity is systematically related to primary sequence, and we subsequently performed computational analyses showing that arginine is the most overrepresented amino acid in crystal-packing interfaces in the Protein Data Bank. Given the similar physicochemical characteristics of arginine and lysine, we hypothesized that multiple lysine-to-arginine (KR) substitutions should improve crystallization. To test this hypothesis, we developed software that ranks lysine sites in a target protein based on the redundancy-corrected KR substitution frequency in homologs. We demonstrate that three unrelated single-domain proteins can tolerate 5-11 KR substitutions with at most minor destabilization and that these substitutions consistently enhance crystallization propensity. This approach rapidly produced a 1.9 Å crystal structure of a human protein domain refractory to crystallization with its native sequence. Structures from bulk-KR-substituted domains show the engineered arginine residues frequently make high-quality hydrogen-bonds across crystal-packing interfaces. We thus demonstrate that bulk KR substitution represents a rational and efficient method for probabilistic engineering of protein surface properties to improve protein crystallization.