Abstract Prokaryotes have evolved a wide repertoire of defense systems to prevent invasion by mobile genetic elements (MGE). However, because MGE are vehicles for the exchange of beneficial accessory genes, defense systems could consequently impede rapid adaptation in microbial populations. Here, we study how defense systems impact horizontal gene transfer (HGT) in the short and long terms. By combining comparative genomics and phylogeny-aware statistical methods, we quantified the association between the presence of 7 widespread defense systems and the abundance of MGE in the genomes of 196 bacterial and 1 archaeal species. We also calculated the differences in the rates of gene gain and loss between lineages that possess and lack each defense system. Our results show that the impact of defense systems on HGT is highly species- and system-dependent. CRISPR-Cas stands out as the defense system that most often associates with a decrease in the number of MGE and reduced gene acquisition. Timescale analysis reveals that defense systems must persist in a lineage for a relatively long time in order exert an appreciable negative impact on HGT. In contrast, at short evolutionary times, defense systems, MGE, and gene gain rates tend to be positively correlated. Based on these results and given the high turnover rates experienced by defense systems, we propose that the inhibitory effect of most defense systems on HGT is masked by recent co-transfer events involving MGE.

Abstract Background A key step for comparative genomics is to group open reading frames into functionally and evolutionarily meaningful gene clusters. Gene clustering is complicated by intraspecific duplications and horizontal gene transfers, that are frequent in prokaryotes. In consequence, gene clustering methods must deal with a trade-off between identifying vertically transmitted representatives of multi-copy gene families (recognizable by synteny conservation) and retrieving complete sets of species-level orthologs. We studied the implications of adopting homology, orthology, or synteny conservation as formal criteria for gene clustering by performing comparative analyses of 125 prokaryotic pangenomes. Results Clustering criteria affect pangenome functional characterization, core genome inference, and reconstruction of ancestral gene content to different extents. Species-wise estimates of pangenome and core genome sizes change by the same factor when using different clustering criteria, which allows for robust cross-species comparisons regardless of the clustering criterion. However, cross-species comparisons of genome plasticity and functional profiles are substantially affected by inconsistencies among clustering criteria. Such inconsistencies are driven not only by mobile genetic elements, but also by genes involved in defense, secondary metabolism, and other accessory functions. In some pangenome features, the variability attributed to methodological inconsistencies can even exceed the effect sizes of ecological and phylogenetic variables. Conclusions Choosing an appropriate criterion for gene clustering is critical to conduct unbiased pangenome analyses. We provide practical guidelines to choose the right method depending on the research goals and the quality of genome assemblies, and a benchmarking dataset to assess the robustness and reproducibility of future comparative studies.

Abstract The Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 has routinely been used as a laboratory model for quorum sensing (QS) studies due to its extensively coordinated regulatory circuits. However, the microevolution of P. aeruginosa laboratory strains resulting in genetic and phenotypic variations have caused inconsistencies in QS research. To investigate the underlying causes and impact of these variations, we analyzed 5 Pseudomonas aeruginosa PAO1 sublines from our laboratory using a combination of phenotypic characterization, high-throughput genome sequencing, and bioinformatic analysis. The major phenotypic variations among the sublines spanned across the levels of QS signals and virulence factors such as pyocyanin and elastase. Furthermore, the sublines exhibited distinct variations in swarming, twitching and biofilm formation. Most of the phenotypic variations were mapped to the effects of mutations in the lasR and mexT , which are key components of the QS circuit. By introducing these mutations in the subline PAO1-E, which is devoid of such mutations, we confirmed their influence on QS, virulence, motility and biofilm formation. The findings further highlight a possible divergent regulatory mechanism between the LasR and MexT in the QS pathways in P. aeruginosa . The results of our study reveal the effects of microevolution on the reproducibility of most research data from QS studies and further highlight mexT as a key component of the QS circuit of P. aeruginosa . Importance Microevolution of P. aeruginosa laboratory strains results in genotypic and phenotypic variations between strains that have a significant influence on QS research. This work highlights the variations present in P. aeruginosa PAO1 sublines and investigates the impact of the genetic variations on the QS circuit and QS-regulated virulence determinants. Using a combination of NGS and phenotypic analysis, we illustrate the impact of microevolution on the reproducibility of QS, virulence, motility, and biofilm studies among 5 sublines. Additionally, we revealed the significant impact of mutations in key genes such as mexT and lasR on the QS circuit and regulation of virulence. In effect, we show the need for limited propagation and proper handling of laboratory isolates to reduce the microevolution.