Abstract As a first line of defence against the environment, the epidermis protect animals from infection and physical damage. In C. elegans , wounding the epidermal epithelium triggers both an immune reaction and a repair response. Exactly how these are controlled, and the degree to which they are inter-connected remains unclear. To address these questions, we established a simple system for simultaneously inflicting precise laser wounds and imaging at high spatial and temporal resolution. We show that in C. elegans , wounding provokes a rapid sealing of the plasma membrane, involving reorganisation of phosphatidylinositol 4,5- bisphosphate domains. This is followed by a radial recruitment at the wound site of EBP-2/EB1, a protein that binds the plus ends of microtubules. EB1 recruitment is accompanied by a reorganisation of microtubules, required for the subsequent recruitment of actin and wound closure. It is also required for the directed trafficking towards the site of injury of the key signalling protein SNF-12. In the absence of SNF-12 recruitment, there is an abrogation of the immune response. Our results suggest that microtubule dynamics coordinate the cytoskeletal changes required for wound repair and the concomitant activation of the innate immune response.

The cytoskeletal protein actin is crucial for cell shape and integrity throughout eukaryotes. Actin filaments perform essential biological functions, including muscle contraction, cell division and tissue morphogenesis. These diverse activities are achieved through the ability of actin filaments to be arranged into diverse architectures, but a detailed appreciation of the dynamic organizational state of the actin filaments has been hindered by available tools. Fluorescence polarization microscopy is uniquely placed for measuring actin organization by exploiting the sensitivity of polarized light excitation to the orientation of fluorophores attached to actin filaments. By engineering constrained fluorescent protein fusions to widely used actin localization reporters, we have succeeded in developing novel genetically-encoded reporters for non-invasive, quantitative measurements of actin filament organization in living cells by fluorescence polarization microscopy. We show examples of actin organization measurements in living mammalian cells in culture, as well as in vivo in fission yeast, C. elegans and Drosophila.

Eukaryotic gene expression requires the coordinated action of transcription factors, chromatin remodelling complexes and RNA polymerase. The conserved nuclear protein Akirin plays a central role in immune gene expression in insects and mammals, linking the SWI/SNF chromatin-remodelling complex with the transcription factor NFκB. Although nematodes lack NFκB, Akirin is also indispensable for the expression of defence genes in the epidermis of Caenorhabditis elegans following natural fungal infection. Through a combination of reverse genetics and biochemistry, we discovered that in C. elegans Akirin has conserved its role of bridging chromatin-remodellers and transcription factors, but that the identity of its functional partners is different since it forms a physical complex with NuRD proteins and the POU-class transcription factor CEH-18. In addition to providing a substantial step forward in our understanding of innate immune gene regulation in C. elegans, our results give insight into the molecular evolution of lineage-specific signalling pathways.

Septins, a conserved family of filament-forming proteins, contribute to eukaryotic cell division, polarity, and membrane trafficking. Septins are thought to act in these processes by scaffolding other proteins to the plasma membrane. The mechanisms by which septins associate with the plasma membrane are not well understood but can involve two polybasic domains and/or an amphipathic helix. We discovered that the genomes of organisms throughout phylogeny, but not most commonly used model organisms, encode one or more septins predicted to have transmembrane domains. The nematode Caenorhabditis elegans, which was thought to express only two septin proteins, UNC-59 and UNC-61, translates multiple isoforms of UNC-61, and one isoform, UNC-61a, is predicted to contain a transmembrane domain. UNC-61a localizes specifically to the apical membrane of the C. elegans vulva and is important for maintaining vulval morphology. UNC-61a partially compensates for the loss of the other two UNC-61 isoforms, UNC-61b and UNC-61c. The UNC-61a transmembrane domain is sufficient to localize a fluorophore to membranes in mammalian cells, and its deletion from UNC-61a recapitulates the phenotypes of unc-61a null animals. The localization and loss-of-function phenotypes of UNC-61a and its transmembrane domain suggest roles in cell polarity and secretion and help explain the cellular and tissue biological underpinnings of C. elegans septin null alleles9 enigmatically hypomorphic phenotypes. Together, our findings reveal a novel mechanism of septin-membrane association with profound implications for the dynamics and regulation of this association.

RNA interference is a powerful tool for dissecting gene function. In Caenorhabditis elegans, ingestion of double stranded RNA causes strong, systemic knockdown of target genes. Further insight into gene function can be revealed by tissue-specific RNAi techniques. Currently available tissue-specific C. elegans strains rely on rescue of RNAi function in a desired tissue or cell in an otherwise RNAi deficient genetic background. In a classroom setting, we attempted to assess the contribution of specific tissues to polyunsaturated fatty acid (PUFA) synthesis using currently available tissue-specific RNAi strains. We discovered that rde-1 (ne219), a commonly used RNAi-resistant mutant strain, retains considerable RNAi capacity against RNAi directed at PUFA synthesis genes. Using GC/MS, we measured changes in the fatty acid products of the desaturase enzymes that synthesize PUFAs in a gene dosage sensitive manner. With this method, we tested a panel of previously described RNAi-deficient mutant strains, and found that almost all of them retained a certain degree of RNAi capacity. Importantly, we found that the before mentioned strain, rde-1 (ne219) and the reported germline only RNAi strain, rrf-1 (pk1417) are not appropriate genetic backgrounds for tissue-specific RNAi experiments. However, the knockout mutant rde-1 (ne300) was strongly resistant to dsRNA induced RNAi, and may be appropriate for construction of robust tissue-specific RNAi strains.

Abstract The apical extracellular matrix acts as crucial barrier, and communicates with the epidermis to trigger protective responses following injury or infection. In C. elegans , we previously showed that mutants lacking cuticle furrows exhibit persistent immune activation (PIA). In a genetic suppressor screen, we identified spia-1 as a key gene downstream of furrow collagens and upstream of immune signaling. spia-1 expression oscillates during larval development, peaking between each moult together with precuticle and cuticule components. It encodes a secreted precuticular protein that transiently localizes to furrows. It shares a novel cysteine-cradle domain (CCD-aECM) with other aECM proteins, predicted to bind proteins with an exposed hydrophobic α helix. SPIA - 1 is proposed to act as a sensor of cuticle damage, mediating immune activation in response to furrow loss and might be part of a checkpoint during the establishment of the new cuticle. This research reinforces the notion of an intricate interplay between cuticle integrity and epidermal immune activation in C. elegans .

Abstract Apical extracellular matrices (aECMs) form a physical barrier to the environment. In C. elegans , the epidermal aECM, the cuticle, is composed mainly of different types of collagen, associated in circumferential ridges separated by furrows. Here, we show that in mutants lacking furrows, the normal intimate connection between the epidermis and the cuticle is lost, specifically at the lateral epidermis, where, in contrast to the dorsal and ventral epidermis, there are no hemidesmosomes. At the ultrastructural level, there is a profound alteration of structures that we term “meisosomes”, in reference to eisosomes in yeast. We show that meisosomes are composed of stacked parallel folds of the epidermal plasma membrane, alternately filled with cuticle. We propose that just as hemidesmosomes connect the dorsal and ventral epidermis, above the muscles, to the cuticle, meisosomes connect the lateral epidermis to it. Moreover, furrow mutants present marked modifications of the biomechanical properties of their skin and exhibit a constitutive damage response in the epidermis. As meisosomes co-localise to macrodomains enriched in phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate, they might act, like eisosomes, as signalling platforms, to relay tensile information from the aECM to the underlying epidermis, as part of an integrated stress response to damage.

When an animal is infected, its innate immune response needs to be tightly regulated across tissues and coordinated with other aspects of organismal physiology. Previous studies with Caenorhabditis elegans have demonstrated that insulin-like peptide genes are differentially expressed in response to different pathogens. They represent prime candidates for conveying signals between tissues upon infection. Here, we focused on one such gene, ins-11 and its potential role in mediating cross-tissue regulation of innate immune genes. While diverse bacterial intestinal infections can trigger the up-regulation of ins-11 in the intestine, we show that epidermal infection with the fungus Drechmeria coniospora triggers an upregulation of ins-11 in the epidermis. Using the Shigella virulence factor OpsF, a MAP kinase inhibitor, we found that in both cases, ins-11 expression is controlled cell autonomously by p38 MAPK, but via distinct transcription factors, STA-2/STAT in the epidermis and HLH-30/TFEB in the intestine. We established that ins-11, and the insulin signaling pathway more generally, are not involved in the regulation of antimicrobial peptide gene expression in the epidermis. The up-regulation of ins-11 in the epidermis does, however, affect intestinal gene expression in a complex manner, and has a deleterious effect on longevity. These results support a model in which insulin signaling, via ins-11, contributes to the coordination of the organismal response to infection, influencing the allocation of resources in an infected animal.