Combining immunotherapy with targeted therapy blocking oncogenic BRAFV600 may result in improved treatments for advanced melanoma. In this study, we developed a BRAFV600E-driven murine model of melanoma, SM1, which is syngeneic to fully immunocompetent mice. SM1 cells exposed to the BRAF inhibitor vemurafenib (PLX4032) showed partial in vitro and in vivo sensitivity resulting from the inhibition of MAPK pathway signaling. Combined treatment of vemurafenib plus adoptive cell transfer therapy with lymphocytes genetically modified with a T-cell receptor (TCR) recognizing chicken ovalbumin (OVA) expressed by SM1-OVA tumors or pmel-1 TCR transgenic lymphocytes recognizing gp100 endogenously expressed by SM1 resulted in superior antitumor responses compared with either therapy alone. T-cell analysis showed that vemurafenib did not significantly alter the expansion, distribution, or tumor accumulation of the adoptively transferred cells. However, vemurafenib paradoxically increased mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling, in vivo cytotoxic activity, and intratumoral cytokine secretion by adoptively transferred cells. Taken together, our findings, derived from 2 independent models combining BRAF-targeted therapy with immunotherapy, support the testing of this therapeutic combination in patients with BRAFV600 mutant metastatic melanoma.

Monocarboxylate transporter 1 (MCT1) inhibition is thought to block tumor growth through disruption of lactate transport and glycolysis. Here, we show MCT1 inhibition impairs proliferation of glycolytic breast cancer cells co-expressing MCT1 and MCT4 via disruption of pyruvate rather than lactate export. MCT1 expression is elevated in glycolytic breast tumors, and high MCT1 expression predicts poor prognosis in breast and lung cancer patients. Acute MCT1 inhibition reduces pyruvate export but does not consistently alter lactate transport or glycolytic flux in breast cancer cells that co-express MCT1 and MCT4. Despite the lack of glycolysis impairment, MCT1 loss-of-function decreases breast cancer cell proliferation and blocks growth of mammary fat pad xenograft tumors. Our data suggest MCT1 expression is elevated in glycolytic cancers to promote pyruvate export that when inhibited, enhances oxidative metabolism and reduces proliferation. This study presents an alternative molecular consequence of MCT1 inhibitors, further supporting their use as anti-cancer therapeutics.

SUMMARY The newly emerged SARS-CoV-2 caused a global pandemic with astonishing mortality and morbidity. The mechanisms underpinning its highly infectious nature remain poorly understood. We report here that SARS-CoV-2 exploits cellular CTP synthetase 1 (CTPS1) to promote CTP synthesis and suppress interferon (IFN) induction. Screening a SARS-CoV-2 expression library identified ORF7b and ORF8 that suppressed IFN induction via inducing the deamidation of interferon regulatory factor 3 (IRF3). Deamidated IRF3 fails to bind the promoters of classic IRF3-responsible genes, thus muting IFN induction. Conversely, a shRNA-mediated screen focused on cellular glutamine amidotransferases corroborated that CTPS1 deamidates IRF3 to inhibit IFN induction. Functionally, ORF7b and ORF8 activate CTPS1 to promote de novo CTP synthesis while shutting down IFN induction. De novo synthesis of small-molecule inhibitors of CTPS1 enabled CTP depletion and IFN induction in SARS-CoV-2 infection, thus impeding SARS-CoV-2 replication. Our work uncovers a strategy that a viral pathogen couples immune evasion to metabolic activation to fuel viral replication. Inhibition of the cellular CTPS1 offers an attractive means for developing antiviral therapy that would be resistant to SARS-CoV-2 mutation.

ABSTRACT Cellular senescence is a mechanism by which cells permanently withdraw from the cell cycle in response to stresses including telomere shortening, DNA damage, or oncogenic signaling. Senescent cells contribute to both age-related degeneration and hyperplastic pathologies, including cancer. In culture, normal human epithelial cells enter senescence after a limited number of cell divisions, known as replicative senescence. Here, to investigate how metabolic pathways regulate replicative senescence, we used LC-MS–based metabolomics to analyze senescent primary human mammary epithelial cells (HMECs). We did not observe significant changes in glucose uptake or lactate secretion in senescent HMECs. However, analysis of intracellular metabolite pool sizes indicated that senescent cells exhibit depletion of metabolites from nucleotide synthesis pathways. Furthermore, stable isotope tracing with 13 C-labeled glucose or glutamine revealed a dramatic blockage of flux of these two metabolites into nucleotide synthesis pathways in senescent HMECs. To test whether cellular immortalization would reverse these observations, we expressed telomerase in HMECs. In addition to preventing senescence, telomerase expression maintained metabolic flux from glucose into nucleotide synthesis pathways. Finally, we investigated whether inhibition of nucleotide synthesis in proliferating HMECs is sufficient to induce senescence. In proliferating HMECs, both pharmacological and genetic inhibition of ribonucleotide reductase regulatory subunit M2 (RRM2), a rate-limiting enzyme in dNTP synthesis, induced premature senescence with concomitantly decreased metabolic flux from glucose into nucleotide synthesis. Taken together, our results suggest that nucleotide synthesis inhibition plays a causative role in the establishment of replicative senescence in HMECs.

Abstract Comprehensive modeling of a whole cell requires an integration of vast amounts of information on various aspects of the cell and its parts. To divide-and-conquer this task, we introduce Bayesian metamodeling, a general approach to modeling complex systems by integrating a collection of heterogeneous input models. Each input model can in principle be based on any type of data and can describe a different aspect of the modeled system using any mathematical representation, scale, and level of granularity. These input models are (i) converted to a standardized statistical representation relying on Probabilistic Graphical Models, (ii) coupled by modeling their mutual relations with the physical world, and (iii) finally harmonized with respect to each other. To illustrate Bayesian metamodeling, we provide a proof-of-principle metamodel of glucose-stimulated insulin secretion by human pancreatic ß-cells. The input models include a coarse-grained spatiotemporal simulation of insulin vesicle trafficking, docking, and exocytosis; a molecular network model of glucose-stimulated insulin secretion signaling; a network model of insulin metabolism; a structural model of glucagon-like peptide-1 receptor activation; a linear model of a pancreatic cell population; and ordinary differential equations for systemic postprandial insulin response. Metamodeling benefits from decentralized computing, while often producing a more accurate, precise, and complete model that contextualizes input models as well as resolves conflicting information. We anticipate Bayesian metamodeling will facilitate collaborative science by providing a framework for sharing expertise, resources, data, and models, as exemplified by the Pancreatic ß-Cell Consortium. Significance Statement Cells are the basic units of life, yet their architecture and function remain to be fully characterized. This work describes Bayesian metamodeling, a modeling approach that divides-and-conquers a large problem of modeling numerous aspects of the cell into computing a number of smaller models of different types, followed by assembling these models into a complete map of the cell. Metamodeling enables a facile collaboration of multiple research groups and communities, thus maximizing the sharing of expertise, resources, data, and models. A proof-of-principle is provided by a model of glucose-stimulated insulin secretion produced by the Pancreatic ß-Cell Consortium.

Abstract Healthy aging can be promoted by enhancing metabolic fitness and physical capacity ( 1, 2 ). Mitochondria are chief metabolic organelles with strong implications in aging ( 3–8 ). In addition to their prominent role in bioenergetics, mitochondria also coordinate broad physiological functions by communicating to other cellular compartments or distal cells using multiple factors ( 9, 10 ), including peptides that are encoded within their own independent genome ( 11, 12 ). However, it is unknown if aging is actively regulated by factors encoded in the mitochondrial genome. MOTS-c is a mitochondrial-encoded peptide that regulates metabolic homeostasis ( 13, 14 ), in part, by translocating to the nucleus to regulate adaptive nuclear gene expression in response to cellular stress ( 15–17 ). Here, we report that MOTS-c is an exercise-induced mitochondrial-encoded peptide that significantly enhanced physical performance when administered to young (2 mo.), middle-aged (12 mo.), and old (22 mo.) mice. In humans, we found that endogenous MOTS-c levels significantly increased in response to exercise in skeletal muscle (11.9-fold) and in circulation (1.5-fold). Systemic MOTS-c treatment in mice significantly enhanced the performance on a treadmill of all age groups (~2-fold). MOTS-c regulated (i) nuclear genes, including those related to metabolism and protein homeostasis, (ii) glucose and amino acid metabolism in skeletal muscle, and (iii) myoblast adaptation to metabolic stress. Late-life (23.5 mo.) initiated intermittent MOTS-c treatment (3x/week) improved physical capacity and trended towards increasing lifespan. Our data indicate that aging is regulated by genes that are encoded not only in the nuclear genome ( 18, 19 ), but also in the mitochondrial genome. Considering that aging is the major risk factor for multiple chronic diseases ( 20, 21 ), our study provides new grounds for further investigation into mitochondrial-encoded regulators of healthy lifespan.

Abstract Chimeric antigen receptors (CARs) are synthetic biomolecules comprised of an extracellular antigen recognition domain and intracellular signaling domains. When expressed in immune cells, CARs direct their host cells to kill diseased cells expressing the antigen recognized by the CAR. Although signaling pathways downstream of CAR activation control the cytotoxic function of CAR-expressing cells, phospho-proteomic studies of CAR signaling have been limited. Most approaches have used antibodies or soluble ligands, rather than cell-displayed antigens, to activate CAR signaling. Here, we demonstrate an efficient and cost-effective label-free phospho-proteomic approach to analyze CAR signaling in immune cells stimulated with antigen-presenting cancer cells. Following co-culture of CAR-T cells with cancer cells, we first preserve phospho-signaling by cross-linking proteins with formalin. Then, we use magnet-activated cell sorting (MACS) to isolate CAR-T cells from the co-culture. Validation experiments demonstrated that formalin fixation did not alter the phospho-proteome and that MACS achieved >90% CAR-T cell purity. Next, we compared the phospho-proteome in CAR-T cells stimulated with either CD19-expressing or non-CD19-expressing SKOV3 ovarian cancer cells. This analysis revealed that CAR signaling activated known pathways including the mitogen- activated protein kinases (MAPKs) ERK1/2. Bioinformatic approaches further showed that CAR activation induced other signaling pathways including the MAPK p38α, protein kinase A, and checkpoint kinase 1 (CHK1). Taken together, this work presents an easy and inexpensive method to better understand CAR immunotherapy by label-free phospho-proteomic analysis of CAR signaling in immune cells stimulated by antigen- presenting cancer cells.