Abstract Differential scanning calorimetry (DSC), optical microscopy, and X‐ray diffraction (XRD) were used to examine the thermal behavior, crystal structure, and crystal morphology of rice bran wax (RBX) in bulk and oil–wax mixtures, and to compare them with those of carnauba wax (CRX) and candellila wax (CLX). The RBX employed in the present study was separated from rice bran oil by winterization, filtration, refinement, bleaching, and deodorization. The RBX crystals melted in the bulk state at 77–79 °C with Δ H melting = 190.5 J/g, which is quite large compared with CLX (129 J/g) and CRX (137.6 J/g). XRD data of the RBX crystals revealed O ⊥ subcell packing and a long spacing value of 6.9 nm. Thin long needle‐shaped crystals were observed in the mixtures of RBX and liquid oils [olive oil and salad oil (canola:soy bean oil = 50:50)]; therefore, the dispersion of RBX crystals in these liquid oils was much finer than that of CRX and CLX crystals. Organogels formed when the mixture of every plant wax and liquid oil was melted at elevated temperature and cooled to ambient temperature. However, the mixture of RBX and olive oil at a concentration ratio of 1:99 wt.% formed an organogel at 20 °C, whereas the lowest concentration necessary for CRX to form an organogel in olive oil was 4 wt.% and that for CLX was 2 wt.%. Observation of the rate of gel formation using DSC and viscosity measurements indicated that the gel structure formed soon after RBX crystallized, whereas a time delay was observed between the organogel formation and wax crystallization of CRX and CLX. These results demonstrate RBX’s good organogel‐forming properties, mostly because of its fine dispersion of long needle like crystals in liquid oil phases.

Abstract Japanese cedar ( Cryptomeria japonica D. Don) is the most important Japanese forest tree, occupying about 44% of artificial forests in Japan, and planted in East Asia, Azores Archipelago, and some islands in the Indian Ocean. Although the huge genome of the species (ca. 11 Gb) with abundant repeat elements might have been an obstacle for genetic analysis, the species is easily propagated by cutting, flowered by plant hormones like gibberellic acid, transformed by agrobacterium, and edited by CRISPR/Cas9. These characteristics of C. japonica are preferable to make the species a model conifer for which reference genome sequences are necessary. In this study, we report the first chromosome-level assembly for C. japonica (2n = 22) using a third generation selfed progeny with an estimated homozygosity of 0.96. Young leaf tissue was used to extract high-molecular-weight DNA (>50 kb) for HiFi PacBio long read sequencing and to construct Hi-C/Omni-C library for Illumina short read sequencing. Using the 29× and 26× genome coverage of HiFi and Illumina reads, respectively, de novo assembly resulted in 2,650 contigs (9.1 Gb in total) with N50 contig size of 12.0 Mb. The Hi-C analysis mapped 97% of the nucleotides on the 11 chromosomes. The assembly was verified by comparing with a consensus linkage map of 7,785 markers. The BUSCO analysis confirmed ~91% of conserved genes. Annotations of genes, repeat elements and synteny with other Cupressaceae and Pinaceae species were performed, providing fundamental resources for genomic research of conifers.

Abstract Practical use of marker-assisted selection (MAS) is limited in conifers because of the difficulty with developing markers due to a rapid decrease in linkage disequilibrium, the limited genomic information available, and the diverse genetic backgrounds among breeding material collections. First, in this study, two families were produced by artificial crossing between two male-sterile trees, Shindai11 and Shindai12, and a plus tree, Suzu-2 ( Ms1/ms1 ) (S11-S and S12-S families, respectively). The segregation ratio between male-sterile and male-fertile trees did not deviate significantly from the expected 1:1 ratio in either family. These results clearly suggested that the male-sterile gene of Shindai11 and Shindai12 is MALE STERALITY 1 ( MS1 ). Because some markers reported previously have not been linkage mapped, we constructed a partial linkage map of the region encompassing MS1 using the S11-S and S12-S families. For the S11-S and S12-S families, 19 and 18 markers were mapped onto the partial linkage maps of MS1 region, respectively. There was collinearity (conserved gene order) between the two partial linkage maps. Two markers (CJt020762_ ms1-1 and reCj19250_2335) were mapped to the same position as the MS1 locus on both maps. Of these markers, we used CJt020762 for MAS in this study. According to the MAS results for 650 trees from six prefectures of Japan (603 trees from breeding materials and 47 trees from the Ishinomaki natural population), five trees in Niigata Prefecture and one tree in Yamagata Prefecture had heterozygous ms1-1 , and three trees in Miyagi Prefecture had heterozygous ms1-2 . The results obtained in this study suggested that there may be geographical hotspots for the ms1-1 and ms1-2 alleles. Because MAS can be used effectively to reduce the labor and time required for selection of trees with a male-sterile gene, the number of breeding materials should increase in the future.

Abstract Sugi ( Cryptomeria japonica D. Don) is an important conifer used for afforestation in Japan. The field of functional genomics is rapidly developing. The genomics of this gymnosperm species is currently being studied. Although its genomic size is 11 Gbps, it is still too large to assemble well within a short period of time. Transcriptomics is the one another approach to address this. Moreover, it is a necessary step in obtaining the complete genomic data. Here we designed a three stages assembling workflow using the de novo transcriptome assembly tools, Oases and Trinity. The three stages in transcriptomics are independent assembly, automatic and semi-automatic integration, and refinement by filtering out potential contamination. We found a set of 49,795 cDNA and an equal number of translated proteins (CJ3006NRE). According to the benchmark of BUSCO, 87.01 % were complete genes, including very high “Complete and single-copy” genes–78.47%. Compared to other full-length cDNA resources, the extent of the coverage in CJ3006NRE suggests that it may be used as the standard for further studies. When two tissue-specific libraries were compared, principal component analysis (PCA) showed that there were significant differences between male strobili and leaf and bark sets. The highest three upregulated transcription factors stood out as orthologs to angiosperms. The identified signature-like domain of the transcription factors demonstrated the accuracy of the assembly. Based on the evaluation of different resources, we demonstrate that our transcriptome assembly output is valuable and useful for further studies in functional genomics and evolutionary biology.

Abstract Identifying causative genes for a target trait in conifer reproduction is challenging for species lacking whole-genome sequences. In this study, we searched for the male-sterility gene ( MS1 ) in Cryptomeria japonica , aiming to promote marker-assisted selection (MAS) of male-sterile C. japonica to reduce the pollinosis caused by pollen dispersal from artificial C. japonica forests in Japan. We searched for mRNA sequences expressed in male strobili and found the gene CJt020762, coding for a lipid transfer protein containing a 4-bp deletion specific to male-sterile individuals. We also found a 30-bp deletion by sequencing the entire gene of another individual with the ms1 . All nine breeding materials with the allele ms1 had either a 4-bp or 30-bp deletion in gene CJt020762, both of which are expected to result in faulty gene transcription and function. Furthermore, the 30-bp deletion was detected from three of five individuals in the Ishinomaki natural forest. From our findings, CJt020762 was considered to be the causative gene of MS1 . Thus, by performing MAS using two deletion mutations as a DNA marker, it will be possible to find novel breeding materials of C. japonica with the allele ms1 adapted to the unique environment of each region of the Japanese archipelago.

Abstract Objective Due to the allergic nature of the pollen of Cryptomeria japonica , the most important Japanese forestry conifer, a pollen-free cultivar is preferred. Mutant trees detected in nature have been used for the production of a pollen-free cultivar. In order to reduce the time and cost needed for the production and breeding, we aimed to develop simple diagnostic molecular markers for mutant alleles of the causative gene MALE STERILITY 1 ( MS1 ) in C. japonica . The expected function of this gene, its two dysfunctional mutations, and genetic diversity were described recently in a related study. Results We have developed PCR and LAMP markers to detect mutant alleles and to present experimental options depending on available laboratory equipment. At field stations, where PCR machines are not available, LAMP markers were developed. LAMP only needs heat-blocks or a water bath to perform the isothermal amplification and assay results can be easily seen by eye. Because the causative mutations were deletions, two kinds of PCR markers, amplified length polymorphism (ALP) and allele specific PCR (ASP) markers, were developed. These assays can be carried out by capillary or agarose gel electrophoresis.

The Japanese subalpine zone is dominated by a distinct and ecologically important conifer rich forest biome, subalpine coniferous forests, that are an outlier of the extensive boreal forests of Eurasia. While being relatively intact compared to other forest biomes in Japan, subalpine coniferous forests are under significant threat from deer browsing, global warming and small populations size effects. However, there is a severe lack of genetic resources available for the study of this biome9s major constituent plant species. This study aims to develop chloroplast genome-based genetic resources for 12 widespread subalpine tree and shrub species via genome skimming of whole genomic DNA using short reads (100-150 bp in length). For 10 species, whole chloroplast genomes were assembled via de novo-based methods from 4-10 individuals per species sampled from across their ranges in Japan and, for non-Japanese endemic species, elsewhere in northeast Asia. A total of 566 single nucleotide polymorphisms for Japanese samples and 768 for all samples (varying from 2 to 202 per species) were identified which were distributed in geographically restricted lineages in most species. In addition, between 9 to 58 polymorphic simple sequence repeat regions were identified per species. For two Ericaceae species (Rhododendron brachycarpum and Vaccinium vitis-idaea) characterized by large chloroplast genomes, de novo assembly failed, but single nucleotide polymorphisms could be identified using reference mapping. This data will be useful for genetic studies of the taxonomic relationship of populations within Japan and to other parts of northeast Asia, investigating phylogeographic patterns within species, conservation genetics and has potential application for studies of environmental and ancient DNA.

Abstract Pollinosis, also known as pollen allergy or hay fever, is a global problem caused by pollen produced by various plant species 1–6 . The wind-pollinated Japanese cedar ( Cryptomeria japonica ) is the largest contributor to severe pollinosis in Japan, where increasing proportions of people have been affected in recent decades 7 . The MS4 ( MALE STERILITY 4 ) locus of Japanese cedar controls pollen production, and its homozygous mutants ( ms4/ms4 ) show abnormal pollen development after the tetrad stage and produce no mature pollen. In this study, we narrowed down the MS4 locus by fine mapping in Japanese cedar and found TKPR1 ( TETRAKETIDE α-PYRONE REDUCTASE ) gene in this region. Transformation experiments using Arabidopsis thaliana showed that single-nucleotide substitution of CjTKPR1 determines pollen production. Broad conservation of TKPR1 beyond plant division could lead to the creation of pollen-free plant not only for Japanese cedar but also for broader plant species.