Antibodies to the hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) glycoproteins are the major mediators of protection against influenza virus infection. Here, we report that current influenza vaccines poorly display key NA epitopes and rarely induce NA-reactive B cells. Conversely, influenza virus infection induces NA-reactive B cells at a frequency that approaches (H1N1) or exceeds (H3N2) that of HA-reactive B cells. NA-reactive antibodies display broad binding activity spanning the entire history of influenza A virus circulation in humans, including the original pandemic strains of both H1N1 and H3N2 subtypes. The antibodies robustly inhibit the enzymatic activity of NA, including oseltamivir-resistant variants, and provide robust prophylactic protection, including against avian H5N1 viruses, in vivo. When used therapeutically, NA-reactive antibodies protected mice from lethal influenza virus challenge even 48 hr post infection. These findings strongly suggest that influenza vaccines should be optimized to improve targeting of NA for durable and broad protection against divergent influenza strains.

ABSTRACT Characterization of functional antibody responses to the N-terminal domain (NTD) of the SARS-CoV-2 spike (S) protein has included identification of both potent neutralizing activity and putative enhancement of infection. Fcγ-receptor (FcγR)-independent enhancement of SARS-CoV-2 infection mediated by NTD-binding monoclonal antibodies (mAbs) has been observed in vitro , but the functional significance of these antibodies in vivo is not clear. Here we studied 1,213 S-binding mAbs derived from longitudinal sampling of B-cells collected from eight COVID-19 convalescent patients and identified 72 (5.9%) mAbs that enhanced infection in a VSV-SARS-CoV-2-S-Wuhan pseudovirus (PV) assay. The majority (68%) of these mAbs recognized the NTD, were identified in patients with mild and severe disease, and persisted for at least five months post-infection. Enhancement of PV infection by NTD-binding mAbs was not observed using intestinal (Caco-2) and respiratory (Calu-3) epithelial cells as infection targets and was diminished or lost against SARS-CoV-2 variants of concern (VOC). Proteomic deconvolution of the serum antibody repertoire from two of the convalescent subjects identified, for the first time, NTD-binding, infection-enhancing mAbs among the circulating immunoglobulins directly isolated from serum ( i.e ., functionally secreted antibody). Functional analysis of these mAbs demonstrated robust activation of FcγRIIIa associated with antibody binding to recombinant S proteins. Taken together, these findings suggest functionally active NTD-specific mAbs arise frequently during natural infection and can last as major serum clonotypes during convalescence. These antibodies display diverse attributes that include FcγR activation, and may be selected against by mutations in NTD associated with SARS-CoV-2 VOC.

Abstract The nature of the interplay between immunity and viral variation is infinitely adaptive. Infection frequently induces immune responses against variation-prone epitopes, rather than against spatially hidden conserved epitopes. It thus remains a substantial challenge to elicit the immune responses to the conserved epitopes providing broad-spectrum immunity. We developed an approach of scaffold-mediated mosaic display to present monomeric influenza virus hemagglutinins (HAs), which exposes highly conserved stem and interface epitopes. Stable monomers were rationally engineered from H1 and H3 subtypes and B type HA trimers, with amino acid mutations at the monomer-monomer interface and for disulfide bond formation, and fused to a self-assembling scaffold, to generate a mosaic HA monomer-displaying nanoparticle, 3HA-np. Immunization with 3HA-np induced broadly neutralizing antibodies (bnAbs) in mice and ferrets and protected against challenges with H1N1 and H3N2 viruses. Competitive immunoassays revealed that 3HA-np induced high interface- and stem-binding Ab titers as compared to head Ab titers, indicating that the monomeric and mosaic nature of 3HA-np elicit cross-reactive Abs. Our results suggest that exposure of the hidden conserved epitope by monomer-displaying nanoparticles is a promising approach to generate a universal influenza vaccine.

Abstract The first encounter with influenza virus biases later immune responses. This “immune imprinting”, formerly from infection within a few years of birth, is in the U.S. now largely from immunization with a quadrivalent, split vaccine (IIV4). In a pilot study of IIV4 imprinting, we characterized, by single-B-cell cultures, NextGen sequencing, and plasma antibody proteomics, the primary antibody responses to influenza in two infants during their first two years of seasonal influenza vaccination. One infant, who received only a single vaccination in Year 1, contracted an influenza B (IBV) infection between the two years, allowing us to compare imprinting by infection and vaccination. That infant had a shift in hemagglutinin (HA)-reactive B-cell specificity from largely influenza A (IAV)-specific in Year 1 to IBV-specific in Year 2, both before and after vaccination. HA-reactive B cells from the other infant maintained a more evenly distributed specificity. In Year 2, class-switched HA-specific B cell IGHV somatic hypermutation (SHM) levels reached average levels seen in adults. The HA-reactive plasma antibody repertoires of both infants comprised a relatively small number of antibody clonotypes, with one or two very abundant clonotypes. Thus, after the Year 2 boost, both infants had overall B cell profiles that resembled those of adult controls. Importance Influenza virus is a moving target for the immune system. Variants emerge that escape protection from antibodies elicited by a previously circulating variant (“antigenic drift”). The immune system usually responds to a drifted influenza virus by mutating existing antibodies rather than by producting entirely new ones. Thus, immune memory of the earliest influenza exposure has a major influence on later responses to infection or vaccination (“immune imprinting”). In the many studies of influenza immunity in adult subjects, imprinting has been from an early infection, since only in the past two decades have infants received influenza immunizations. The work reported in this paper is a pilot study of imprinting in two infants by the flu vaccine, which they received before experiencing an influenza infection. The results suggest that a quadrivalent (four-subtype) vaccine may provide an immune imprint less dominated by one subtype than does a monovalent infection.

ABSTRACT Novel animal influenza viruses emerge, initiate pandemics and become endemic seasonal variants that have evolved to escape from prevalent herd immunity. These processes often outpace vaccine-elicited protection. Focusing immune responses on conserved epitopes may impart durable immunity. We describe a focused, protective antibody response, abundant in memory and serum repertoires, to a conserved region at the influenza hemagglutinin head interface. Structures of eleven examples, eight reported here, from seven human donors demonstrate the convergence of responses on a single epitope. The eleven are genetically diverse, with one class having a common, IGκV1-39, light chain. All of the antibodies bind HAs from multiple serotypes. The lack of apparent genetic restriction and potential for elicitation by more than one serotype may explain their abundance. We define the head interface as a major target of broadly protective antibodies with the potential to influence the outcomes of influenza infection.