CRISPR-Cas systems are widely used for genome engineering technologies, and in their natural setting, they play crucial roles in bacterial and archaeal adaptive immunity, protecting against phages and other mobile genetic elements. Previously we discovered bacteriophage-encoded Cas9-specific anti-CRISPR (Acr) proteins that serve as countermeasures against host bacterial immunity by inactivating their CRISPR-Cas systems. We hypothesized that the evolutionary advantages conferred by anti-CRISPRs would drive the widespread occurrence of these proteins in nature. We have identified new anti-CRISPRs using the bioinformatic approach that successfully identified previous Acr proteins against Neisseria meningitidis Cas9 (NmeCas9). In this work we report two novel anti-CRISPR families in strains of Haemophilus parainfluenzae and Simonsiella muelleri, both of which harbor type II-C CRISPR-Cas systems. We characterize the type II-C Cas9 orthologs from H. parainfluenzae and S. muelleri, show that the newly identified Acrs are able to inhibit these systems, and define important features of their inhibitory mechanisms. The S. muelleri Acr is the most potent NmeCas9 inhibitor identified to date. Although inhibition of NmeCas9 by anti-CRISPRs from H. parainfluenzae and S. muelleri reveals cross-species inhibitory activity, more distantly related type II-C Cas9s are not inhibited by these proteins. The specificities of anti-CRISPRs and divergent Cas9s appear to reflect co-evolution of their strategies to combat or evade each other. Finally, we validate these new anti-CRISPR proteins as potent off-switches for Cas9 genome engineering applications.

Identification of modules in molecular networks is at the core of many current analysis methods in biomedical research. However, how well different approaches identify disease-relevant modules in different types of gene and protein networks remains poorly understood. We launched the “Disease Module Identification DREAM Challenge”, an open competition to comprehensively assess module identification methods across diverse protein-protein interaction, signaling, gene co-expression, homology, and cancer-gene networks. Predicted network modules were tested for association with complex traits and diseases using a unique collection of 180 genome-wide association studies (GWAS). Our critical assessment of 75 contributed module identification methods reveals novel top-performing algorithms, which recover complementary trait-associated modules. We find that most of these modules correspond to core disease-relevant pathways, which often comprise therapeutic targets and correctly prioritize candidate disease genes. This community challenge establishes benchmarks, tools and guidelines for molecular network analysis to study human disease biology ( ).

While genome editing has been revolutionized by the advent of CRISPR-based nucleases, difficulties in achieving efficient, nuclease-mediated, homology-directed repair (HDR) still limit many applications. Commonly used DNA donors such as plasmids suffer from low HDR efficiencies in many cell types, as well as integration at unintended sites. In contrast, single-stranded DNA (ssDNA) donors can produce efficient HDR with minimal off-target integration. Here, we describe the use of ssDNA phage to efficiently and inexpensively produce long circular ssDNA (cssDNA) donors. These cssDNA donors serve as efficient HDR templates when used with Cas9 or Cas12a, with integration frequencies superior to linear ssDNA (lssDNA) donors. To evaluate the relative efficiencies of imprecise and precise repair for a suite of different Cas9 or Cas12a nucleases, we have developed a modified Traffic Light Reporter (TLR) system [TLR-Multi-Cas Variant 1 (MCV1)] that permits side-by-side comparisons of different nuclease systems. We used this system to assess editing and HDR efficiencies of different nuclease platforms with distinct DNA donor types. We then extended the analysis of DNA donor types to evaluate efficiencies of fluorescent tag knock-ins at endogenous sites in HEK293T and K562 cells. Our results show that cssDNA templates produce efficient and robust insertion of reporter tags. Targeting efficiency is high, allowing production of biallelic integrants using cssDNA donors. cssDNA donors also outcompete lssDNA donors in template-driven repair at the target site. These data demonstrate that circular donors provide an efficient, cost-effective method to achieve knock-ins in mammalian cell lines.

CRISPR-Cas systems are bacterial adaptive immune pathways that have revolutionized biotechnology and biomedical applications. Despite the potential for human therapeutic development, there are many hurdles that must be overcome before its use in clinical settings. Some clinical safety concerns arise from persistent activity of Cas9 after the desired editing is complete, or from editing activity in unintended cell types or tissues upon in vivo delivery [e.g. by adeno-associated viruses (AAV)]. Although tissue-specific promoters and serotypes with tissue tropisms can be used, suitably compact promoters are not always available for desired cell types, and AAV tissue tropisms are not absolute. To reinforce tissue-specific editing, we exploited anti-CRISPR proteins (Acrs), which are proteins evolved as countermeasures against CRISPR immunity. To inhibit Cas9 in all ancillary tissues without compromising editing in the target tissue, we established a flexible platform in which an Acr transgene is repressed by endogenous, tissue-specific microRNAs (miRNAs). We demonstrate that miRNAs regulate the expression of an Acr transgene bearing miRNA-binding sites in its 3' UTR, and control subsequent genome editing outcomes in a cell-type specific manner. We also show that the strategy is applicable to multiple Cas9 orthologs and their respective Acrs. Furthermore, we demonstrate that in vivo delivery of Cas9 and Acrs that are targeted for repression by liver-specific miR-122 allow editing in the liver while Acrs devoid of miRNA regulation prevent Cas9 activity. This strategy provides additional safeguards against off-tissue genome editing by confining Cas9 activity to selected cell types.