Integrins in focal adhesions (FAs) mediate adhesion and force transmission to extracellular matrices essential for cell motility, proliferation and differentiation. Different fibronectin-binding integrins, simultaneously present in FAs, perform distinct functions. Yet, how integrin dynamics control biochemical and biomechanical processes in FAs is still elusive. Using single-protein tracking and super-resolution imaging we revealed the dynamic nano-organizations of integrins and talin inside FAs. Integrins reside in FAs through free-diffusion and immobilization cycles. Integrin activation promotes immobilization, stabilized in FAs by simultaneous connection to fibronectin and actin-binding proteins. Talin is recruited in FAs directly from the cytosol without membrane free-diffusion, restricting integrin immobilization to FAs. Immobilized β3-integrins are enriched and stationary within FAs, whereas immobilized β1-integrins are less enriched and exhibit rearward movements. Talin is enriched and mainly stationary, but also exhibited rearward movements in FAs, consistent with stable connections with both β-integrins. Thus, differential transmission of actin motion to fibronectin occurs through specific integrins within FAs.

Abstract MDGAs are molecules that can bind neuroligins in cis and interfere with trans-synaptic neurexin-neuroligin interactions, thereby impairing synapse development. However, the sub-cellular localization and dynamics of MDGAs, as well as their specific mode of action in neurons are still unclear. Here, using both surface immunostaining of endogenous MDGAs and single molecule tracking of recombinant MDGAs in dissociated hippocampal neurons, we show that MDGA1 and MDGA2 molecules are homogeneously distributed and exhibit fast membrane diffusion, with a small reduction in mobility across neuronal maturation in culture Using shRNAs and CRISPR/Cas9 strategies to knock-down/out MDGA1 or MDGA2, we demonstrate an increase in the density of excitatory synapses accompanied by enhanced membrane immobilization and an increase in the phosphotyrosine level of neuroligins associated with excitatory post-synaptic differentiation. Finally, we show that decreasing MDGA expression level reduces the mobility of AMPA receptors and increases the frequency of AMPA receptor mediated mEPSCs. Overall, our results support a mechanism by which interactions between MDGAs and neuroligin-1 delays the assembly of functional excitatory synapses containing AMPA receptors.

Neuroligins (Nlgs) are adhesion proteins mediating trans-synaptic contacts in neurons. However, conflicting results around their role in synaptic differentiation arise from the various techniques used to manipulate Nlg expression. Orthogonally to these approaches, we triggered here the phosphorylation of endogenous Nlg1 in CA1 hippocampal neurons using a photoactivatable tyrosine kinase receptor (optoFGFR1). Light stimulation for 24 h selectively increased dendritic spine density and AMPA receptor-mediated EPSCs in wild-type neurons, but not in Nlg1 knock-out neurons or when endogenous Nlg1 was replaced by a non-phosphorylatable mutant (Y782F). Moreover, light stimulation of optoFGFR1 partially occluded LTP. Combined with computer simulations, our data support a model by which Nlg1 tyrosine phosphorylation promotes the assembly of an excitatory post-synaptic scaffold that captures surface AMPA receptors. This optogenetic strategy thus highlights the impact of Nlg1 intracellular signaling in synaptic differentiation and potentiation, while enabling an acute control of these mechanisms.

Abstract Neuroligins (NLGNs) are important cell adhesion molecules mediating trans-synaptic contacts between neurons. However, the high-yield biochemical isolation and visualization of endogenous NLGNs have been hampered by the lack of efficient antibodies to these proteins. Thus, to reveal their sub-cellular distribution, binding partners, and synaptic function, NLGNs have been extensively manipulated using knock-down, knock-out, or over-expression approaches, overall leading to controversial results. As an alternative to the manipulation of NLGN expression level, we describe here the generation of a new transgenic mouse strain in which native NLGN1 was N-terminally tagged with a small biotin acceptor peptide (bAP) that can be enzymatically biotinylated by the exogenous delivery of biotin ligase. After showing that knock-in mice exhibit normal behavior as well as similar synaptic number, ultrastructure, transmission properties, and protein expression levels when compared to wild type counterparts, we exploited the fact that biotinylated bAP-NLGN1 can be selectively isolated or visualized using high-affinity streptavidin conjugates. Using immunoblotting and immunofluorescence, we show that bAP-NLGN1 binds both PSD-95 and gephyrin and distributes equally well at excitatory and inhibitory synapses, challenging the historical view that NLGN1 is exclusively localized at excitatory synapses. Using super-resolution fluorescence microscopy and electron microscopy, we further highlight that bAP-NLGN1 forms in the synaptic cleft a subset of nanodomains each containing a few NLGN1 dimers, while the number of nanodomains per synapse positively scales with the post-synapse size. Overall, our study not only provides a novel, extensively characterized transgenic mouse model which will be made available to the scientific community, but also an unprecedented view of the nanoscale organization of endogenous NLGN1.

Summary Homeostatic synaptic plasticity (HSP) is a process by which neurons adjust synaptic strengths to compensate for various perturbations and which allows to stabilize neuronal activity. Yet, whether the highly diverse synapses harboring a neuron respond uniformly to a same perturbation is unclear and the underlying molecular determinants remain to be identified. Here, using patch-clamp recordings, immunolabeling and imaging approaches, we report that the ability of individual synapses to undergo HSP in response to activity-deprivation paradigms depends on the local expression of the spine apparatus related protein synaptopodin (SP) acting as a synaptic tag to promote AMPA receptor synaptic accumulation and spine growth. Gain and loss-of-function experiments indicate that this process relies on the local de-repression of SP translation by miR124 which supports both non-uniform and synapse-autonomous HSP induced by global or inputspecific activity deprivation, respectively. Our findings uncover an unexpected synaptic-tagging mechanism for HSP, whose molecular actors are intriguingly shared with Hebbian plasticity and linked to multiple neurological diseases.