Summary Carbohydrate binding modules (CBMs) are non-catalytic domains associated with cell wall degrading carbohydrate-active enzymes (CAZymes) that are often present in nature tethered to distinct catalytic domains (CD). Fluorescently labeled CBMs have been also used to visualize the presence of specific polysaccharides present in the cell wall of plant cells and tissues. Previous studies have provided a qualitative analysis of CBM-polysaccharide interactions, with limited characterization of optimal CBM designs for recognizing specific plant cell wall glycans. Furthermore, CBMs also have not been used to study cell wall regeneration in plant protoplasts. Here, we examine the dynamic interactions of engineered type-A CBMs (from families 3a and 64) with crystalline cellulose-I and phosphoric acid swollen cellulose (PASC). We generated tandem CBM designs to determine their binding parameters and reversibility towards cellulose-I using equilibrium binding assays. Kinetic parameters - adsorption ( k on ) and desorption ( k off ) rate constants-for CBMs towards nanocrystalline cellulose were determined using quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D). Our results indicate that tandem CBM3a exhibits a five-fold increased adsorption rate to cellulose compared to single CBM3a, making tandem CBM3a suitable for live-cell imaging applications. We next used engineered CBMs to visualize Arabidopsis thaliana protoplasts with regenerated cell walls using wide-field fluorescence and confocal laser scanning microscopy (CLSM). In summary, tandem CBMs offer a novel polysaccharide labeling probe for real-time visualization of growing cellulose chains in living Arabidopsis protoplasts.

Abstract Fluorescence imaging is an effective method for detecting porphyrin production in bacteria, leveraging the natural fluorescence properties of porphyrins. Here we use a simple, lightweight, hands-free device for rapid, non-invasive assessments in clinical settings, microbial research, and diagnostic applications. Specifically in this study, we examined 15 bacterial and 2 fungal strains commonly associated with skin, oral, and/or multi-site infections at wound sites for their ability to autofluoresce based on their porphyrin production. We utilized Remel Porphyrin Test Agar and blood agar plates to monitor red fluorescence over several days of growth under aerobic or anaerobic conditions using the wearable REVEAL FC imaging system with a 405 nm violet excitation headlight paired with eyewear carrying 430 nm emission lenses. Fourteen of the fifteen bacteria produced red fluorescence when grown on Porphyrin Test Agar and nine of the fifteen bacteria also displayed red fluorescence on blood agar plates, consistent with their ability to synthesize porphyrins. Taken together, our results elucidate the sensitivity, effectiveness, and convenience of using wearable technology to detect pathogens that produce porphyrin-specific fluorescence. Consequently, the REVEAL system has immense potential to help diagnose wound infections, direct clinical procedures, and guide treatment options in real-time using fluorescence imaging all while minimizing the risk of contamination. Importance Statement Fluorescence imaging is a simple technique used to detect a substance called porphyrin, which some microbes produce, and which naturally glows under specific light. In this study, we used a hands-free, wearable device to check for porphyrin in various bacteria and fungi that often infect wounds. This device shines a violet light on bacteria grown in the lab on solid media containing heme precursors, and if they produce porphyrin, they glow red. This method, tested on 15 bacterial and 2 fungal strains, proved to be effective and convenient. This technology has the potential to help clinicians diagnose infections and decide on treatments more efficiently and safely.

Plant cell walls are composed of polysaccharides among which cellulose is the most abundant component. Cellulose is processively synthesized as bundles of linear β-1,4-glucan homopolymer chains via the coordinated action of multiple enzymes in cellulose synthase complexes (CSCs) embedded within the plasma cell membrane. Plant cell walls are composed of multiple layers of cellulose fibrils that form highly intertwined extracellular matrix networks. However, it is not yet clear as to how cellulose fibrils synthesized by multiple CSCs are assembled into the intricate cellulose network deposited on plant cell surfaces. Herein, we have established an in vivo time-resolved imaging platform for visualizing cellulose during its biosynthesis and assembly into a complex fibrillar network on the surface of Arabidopsis thaliana mesophyll protoplasts as the primary cell wall regenerates. We performed total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) with fluorophore-conjugated tandem carbohydrate binding modules (tdCBMs) that were engineered to specifically bind to nascent cellulose fibrils. Together with a well-controlled environment, it was possible to monitor in vivo cellulose fibril synthesis dynamics in a time-resolved manner for nearly one day of continuous cell wall regeneration on protoplast cell surfaces. Our observations provide the basis for a novel model of cellulose fibril network development in protoplasts driven by complex interplay of multi-scale dynamics that include: rapid diffusion and coalescence of short nascently synthesized cellulose fibrils; processive elongation of single fibrils; and cellulose fibrillar network rearrangement during cell wall maturation. This platform is valuable for exploring mechanistic aspects of cell wall synthesis while visualizing cellulose microfibrils assembly.