Transposon tagging to clonally trace progenitors and stem cells provides evidence for a substantially revised roadmap for unperturbed haematopoiesis, and highlights unique properties of multipotent progenitors and haematopoietic stem cells in situ. Generating new blood, or haematopoiesis, relies on a pool of stem cells that produces multipotent progenitors and differentiated blood and immune cells. Different models have been proposed to explain the hierarchical organization and fate decision of these cells, mainly using transplantation to assess lineage potential. Fernando Camargo and colleagues use transposon tagging to trace progenitors and stem cells clonally in unperturbed haematopoiesis and apply single-cell RNA sequencing to assess the transcriptome of the cells produced. They find the coexistence of unilineage- and oligolineage-producing clones and suggest that the megakaryocyte lineage arises largely independently of other haematopoietic fates, and can do so from long-term haematopoietic stem cells directly. Haematopoiesis, the process of mature blood and immune cell production, is functionally organized as a hierarchy, with self-renewing haematopoietic stem cells and multipotent progenitor cells sitting at the very top1,2. Multiple models have been proposed as to what the earliest lineage choices are in these primitive haematopoietic compartments, the cellular intermediates, and the resulting lineage trees that emerge from them3,4,5,6,7,8,9,10. Given that the bulk of studies addressing lineage outcomes have been performed in the context of haematopoietic transplantation, current models of lineage branching are more likely to represent roadmaps of lineage potential than native fate. Here we use transposon tagging to clonally trace the fates of progenitors and stem cells in unperturbed haematopoiesis. Our results describe a distinct clonal roadmap in which the megakaryocyte lineage arises largely independently of other haematopoietic fates. Our data, combined with single-cell RNA sequencing, identify a functional hierarchy of unilineage- and oligolineage-producing clones within the multipotent progenitor population. Finally, our results demonstrate that traditionally defined long-term haematopoietic stem cells are a significant source of megakaryocyte-restricted progenitors, suggesting that the megakaryocyte lineage is the predominant native fate of long-term haematopoietic stem cells. Our study provides evidence for a substantially revised roadmap for unperturbed haematopoiesis, and highlights unique properties of multipotent progenitors and haematopoietic stem cells in situ.

Mutation accumulation during life can contribute to hematopoietic dysfunction; however, the underlying dynamics are unknown. Somatic mutations in blood progenitors can provide insight into the rate and processes underlying this accumulation, as well as the developmental lineage tree and stem cell division numbers. Here, we catalog mutations in the genomes of human-bone-marrow-derived and umbilical-cord-blood-derived hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). We find that mutations accumulate gradually during life with approximately 14 base substitutions per year. The majority of mutations were acquired after birth and could be explained by the constant activity of various endogenous mutagenic processes, which also explains the mutation load in acute myeloid leukemia (AML). Using these mutations, we construct a developmental lineage tree of human hematopoiesis, revealing a polyclonal architecture and providing evidence that developmental clones exhibit multipotency. Our approach highlights features of human native hematopoiesis and its implications for leukemogenesis.

ABSTRACT Some cancers originate from a single mutation event in a single cell. For example, blood cancers known as myeloproliferative neoplasms (MPN) are thought to originate through the acquisition of a driver mutation (most commonly JAK2 -V617F) in a hematopoietic stem cell (HSC). However, when the mutation first occurs in individual patients and how it impacts the behavior of HSCs in their native context is not known. Here we quantified the impact of the JAK2- V617F mutation on the proliferation dynamics of HSCs and the differentiation trajectories of their progenies in individual MPN patients. We reconstructed the lineage history of individual HSCs obtained from MPN patients using the patterns of spontaneous somatic mutations accrued in their genomes over time. Strikingly, we found that the JAK2- V617F mutation occurred in a single HSC several decades before MPN diagnosis — at age 9±2 years in a 34-year-old patient, and at age 19±3 years in a 63-year-old patient. For each patient, we inferred the number of mutated HSCs over time and computed their fitness. The population of JAK2 -mutated HSCs grew exponentially by 63±15% and 44±13% every year in the two patients, respectively. To contrast the differentiation trajectories of the JAK2 -mutated HSCs with those of healthy HSCs, we simultaneously measured the full transcriptome and somatic mutations in single hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). We found that the fraction of JAK2 -mutant HSPCs varied significantly across different myeloid cell types within the same patient. The erythroid progenitor cells were often entirely JAK2 -mutant, even when the peripheral blood JAK2 -V617F allele burden was low. The novel biological insights uncovered by this work have implications for the prevention and treatment of MPN, as well as the accurate assessment of disease burden in patients. The technology platforms and computational frameworks developed here are broadly applicable to other types of hematological malignancies and cancers.

Tracing the lineage history of cells is key to answering diverse and fundamental questions in biology. Particularly in the context of stem cell biology, analysis of single cell lineages in their native state has elucidated novel fates and highlighted heterogeneity of function. Coupling of such ancestry information with other molecular readouts represents an important goal in the field. Here, we describe the CARLIN (for CRISPR Array Repair LINeage tracing) mouse line and corresponding analysis tools that can be used to simultaneously interrogate the lineage and transcriptomic information of single cells in vivo . This model exploits CRISPR technology to generate up to 44,000 transcribed barcodes in an inducible fashion at any point during development or adulthood, is compatible with sequential barcoding, and is fully genetically defined. We have used CARLIN to identify intrinsic biases in the activity of fetal liver hematopoietic stem cell (HSC) clones and to uncover a previously unappreciated clonal bottleneck in the response of HSCs to injury. CARLIN also allows the unbiased identification of transcriptional signatures based on in vivo stem cell function without a need for markers or cell sorting.