Abstract Vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT) is a rare but extremely dangerous side effect that has been reported for several adenoviral (Ad)-vectored COVID-19 vaccines. VITT pathology had been linked to production of antibodies that recognize platelet factor 4 (PF4), an endogenous chemokine. In this work we characterize anti-PF4 antibodies obtained from a VITT patient’s blood. Intact-mass MS measurements indicate that a significant fraction of this ensemble is comprised of antibodies representing a limited number of clones. MS analysis of large antibody fragments (the light chain, as well as the Fc/2 and Fd fragments of the heavy chain) confirms the monoclonal nature of this component of the anti-PF4 antibodies repertoire, and reveals the presence of a fully mature complex biantennary N-glycan within its Fd segment. Peptide mapping using two complementary proteases and LC-MS/MS analysis were used to determine the amino acid sequence of the entire light chain and over 98% of the heavy chain (excluding a short N-terminal segment). The sequence analysis allows the monoclonal antibody to be assigned to IgG2 subclass and verify that the light chain belongs to the λ-type. Incorporation of enzymatic de- N -glycosylation into the peptide mapping routine allows the N -glycan in the Fab region of the antibody to be localized to the framework 3 region of the V H domain. This novel N -glycosylation site (absent in the germline sequence) is a result of a single mutation giving rise to an NDT motif in the antibody sequence. Peptide mapping also provides a wealth of information on lower-abundance proteolytic fragments derived from the polyclonal component of the anti-PF4 antibody ensemble, revealing the presence of all four subclasses (IgG1 through IgG4) and both types of the light chain (λ and κ). The structural information reported in this work will be indispensable for understanding the molecular mechanism of VITT pathogenesis.

Abstract Cell division, wherein one cell divides into two daughter cells, is fundamental to all living organisms. Cytokinesis, the final step in cell division, begins with the formation of an actomyosin contractile ring, positioned midway between the segregated chromosomes. Constriction of the ring with concomitant membrane deposition in a spatiotemporal manner generates a cleavage furrow that physically separates the cytoplasm. Unique lipids with specific biophysical properties have been shown to localize to intercellular bridges (also called midbody) connecting the two dividing cells; however, their biological roles and delivery mechanisms remain largely unknown. In this study, we show that Ceramide phosphoethanolamine (CPE), the structural analog of sphingomyelin, has unique acyl chain anchors in spermatocytes and is essential for meiotic cytokinesis. The head group of CPE is also important for spermatogenesis. We find that aberrant central spindle and contractile ring behavior but not mislocalization of phosphatidylinositol phosphates (PIPs) at the plasma membrane is responsible for the male meiotic cytokinesis defect in CPE deficient animals. Further, we demonstrate the enrichment of CPE in multivesicular bodies marked by Rab7, which in turn localize to cleavage furrow. Volume electron microscopy analysis using correlative light and focused ion beam scanning electron microscopy shows that CPE enriched Rab7 positive endosomes are juxtaposed on contractile ring material. Correlative light and transmission electron microscopy reveal Rab7 positive endosomes as a multivesicular body-like organelle that releases its intraluminal vesicles in the vicinity of ingressing furrows. Genetic ablation of Rab7 or expression of dominant negative Rab11 results in significant meiotic cytokinesis defects. Our results imply that endosomal delivery of CPE to ingressing membranes is crucial for meiotic cytokinesis.

Abstract The massive COVID-19 vaccine roll-out campaign illuminated a range of rare side effects, the most dangerous of which – vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT) – is caused by adenoviral (Ad)-vectored vaccines. VITT occurrence had been linked to production of pathogenic antibodies that recognize an endogenous chemokine, platelet factor 4 (PF4). Mass spectrometry (MS)-based evaluation of the ensemble of anti-PF4 antibodies obtained from a VITT patient’s blood indicates that its major component is a monoclonal antibody. Structural characterization of this antibody reveals several unusual characteristics, such as the presence of an N -glycan in the Fab segment and high density of acidic amino acid residues in the CDR regions. A recombinant version of this antibody (RVT1) was generated by transient expression in mammalian cells based on the newly determined sequence. It captures the key properties of VITT antibodies, such as their ability to activate platelets in a PF4-dependent fashion. Homology modeling of the Fab segment reveals a well-defined polyanionic paratope, and the docking studies indicate that the polycationic segment of PF4 readily accommodates two Fab segments, cross-linking the antibodies to yield polymerized immune complexes. Their existence was verified with native MS by detecting assemblies as large as (RVT1) 3 (PF4) 2 , pointing out at FcγRIIa-mediated platelet activation as the molecular mechanism underlying VITT clinical manifestations. In addition to high PF4 affinity, RVT1 readily binds other polycationic targets, indicating a polyreactive nature of this antibody. This surprising polyspecificity not only sheds light on VITT etiology, but also opens up a range of opportunities to manage this pathology. Significance Statement Vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT) is a dangerous side effect of adenoviral-vectored vaccines that is linked to the emergence of autoantibodies recognizing platelet factor 4 (PF4). We have engineered a recombinant VITT antibody by sequencing a VITT patient-derived anti-PF4 monoclonal antibody that causes platelet activation and triggers thrombosis. This antibody was used to characterize architecture of the pathogenic immune complexes with a combination of biophysical and computational approaches, revealing the molecular mechanism of VITT. The results of this work demonstrate the critical role of electrostatics in PF4 recognition by the pathogenic antibody and the polyspecificity of the latter. Availability of the engineered VITT antibody will be invaluable for future studies aiming at understanding the general mechanistic features of autoimmune pathologies.

This manuscript has been withdrawn following erroneous duplicate posting. The appropriate version is available at 10.1101/2021.04.27.441622.