The applications of extracellular vesicles (EVs) as therapeutics or nanocarriers for cell-free therapies necessitates a comprehensive assessment of their bioactivity, batch-to-batch reproducibility, and stability. Due to the considerable heterogeneity in EV preparations, there is a crucial need for a sensitive functional test to complement established methods for EV characterization. In this study, we introduce the detectEVs assay, an enzymatic-based approach designed to evaluate EV bioactivity. Specifically, this assay enables quantitative measurement of both EV bioactivity and integrity in small-size EV samples through a single-step analysis. Moreover, the detectEV assay proves effective for quality checking EVs post-isolation, during storage, and loading processes. The development and validation of this robust and straightforward test were extended to EVs from different cell lines and hold promise for enhancing the characterization of EVs, thereby enabling the prediction of their potency.

Abstract BACKGROUND A cell operates as an interconnected bioelectrical circuit, utilising electron transfer processes for intracellular communication, with cytochrome c (Cyt c) playing a pivotal role. The redox processes of Cyt c, occurring via electron tunnelling, are essential for its translocation into the cytosol and modulation of its conformation to bind apoptotic protease activating factor 1. This highlights the need for novel technologies capable of interacting with these processes at the atomic scale to control downstream effects and induce apoptosis in cancer cells. METHODS We demonstrate that ‘bio-nanoantennae’, when supplied with an electrical current, enable quantum biological tunnelling for electron transfer (QBET) and facilitate cellular apoptosis in patient-derived IDH wild-type glioblastoma from both the infiltrative tumour margin and proliferative core. The bio-nanoantennae were constructed from gold nanoparticles functionalised with reduced Cyt c and zinc porphyrin as a redox couple. RESULTS Electrical polarisation of these bio-nanoantennae via resonant alternating currents in preclinical glioblastoma cells led to decreased metabolic activity and reduced cell viability by oxidizing Cyt c, thus inducing cellular stress. No significant effect was observed in healthy human astrocyte counterparts. The cytosol localised bio-nanoantennae induced differential gene expression related to ion channels, apoptosis, cancer proliferation and tumour suppression upon activation, in tumour relative to astrocyte cell populations. The bio-nanoantennae were also tested in 3D glioblastoma spheroid models, showing similar effects, and in vivo studies demonstrated a significant reduction in glioblastoma xenograft tumour size. CONCLUSION We propose that bio-nanoantennae modulate the redox state of Cyt c under an electrical field through QBET. To validate this, we investigated the tunnel junction energy and plasmon resonance scattering, and developed a mathematical model to explain the system’s behaviour. This innovative wireless electrical–molecular nanodevice, capable of inducing cancer cell apoptosis, paves the way for further applications of quantum signalling as a new (non-pharmacological) therapeutic paradigm.

Abstract The application of extracellular vesicles (EVs) as therapeutics or nanocarriers in cell‐free therapies necessitates meticulous evaluations of different features, including their identity, bioactivity, batch‐to‐batch reproducibility, and stability. Given the inherent heterogeneity in EV preparations, this assessment demands sensitive functional assays to provide key quality control metrics, complementing established methods to ensure that EV preparations meet the required functionality and quality standards. Here, we introduce the detectEV assay, an enzymatic‐based approach for assessing EV luminal cargo bioactivity and membrane integrity. This method is fast, cost‐effective, and quantifiable through enzymatic units. Utilizing microalgae‐derived EVs, known as nanoalgosomes, as model systems, we optimised the assay parameters and validated its sensitivity and specificity in quantifying the enzymatic activity of esterases within the EV lumen while also evaluating EV membrane integrity. Compared to conventional methods that assess physicochemical features of EVs, our single‐step analysis efficiently detects batch‐to‐batch variations by evaluating changes in luminal cargo bioactivity and integrity across various EV samples, including differences under distinct storage conditions and following diverse isolation and exogenous loading methods, all using small sample sizes. The detectEV assay's application to various human‐derived EV types demonstrated its versatility and potential universality. Additionally, the assay effectively predicted EV functionality, such as the antioxidant activity of different nanoalgosome batches. Our findings underscore the detectEV assay's utility in comprehensive characterization of EV functionality and integrity, enhancing batch‐to‐batch reproducibility and facilitating their therapeutic applications.