Article30 July 2010free access ADAM10 is the physiologically relevant, constitutive α-secretase of the amyloid precursor protein in primary neurons Peer-Hendrik Kuhn Peer-Hendrik Kuhn Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Huanhuan Wang Huanhuan Wang Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Bastian Dislich Bastian Dislich Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Search for more papers by this author Alessio Colombo Alessio Colombo Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Search for more papers by this author Ulrike Zeitschel Ulrike Zeitschel Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Leipzig, Germany Search for more papers by this author Joachim W Ellwart Joachim W Ellwart Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, Institute of Molecular Immunology, Munich, Germany Search for more papers by this author Elisabeth Kremmer Elisabeth Kremmer Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, Institute of Molecular Immunology, Munich, Germany Search for more papers by this author Steffen Roßner Steffen Roßner Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Leipzig, Germany Search for more papers by this author Stefan F Lichtenthaler Corresponding Author Stefan F Lichtenthaler Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Search for more papers by this author Peer-Hendrik Kuhn Peer-Hendrik Kuhn Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Huanhuan Wang Huanhuan Wang Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Bastian Dislich Bastian Dislich Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Search for more papers by this author Alessio Colombo Alessio Colombo Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Search for more papers by this author Ulrike Zeitschel Ulrike Zeitschel Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Leipzig, Germany Search for more papers by this author Joachim W Ellwart Joachim W Ellwart Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, Institute of Molecular Immunology, Munich, Germany Search for more papers by this author Elisabeth Kremmer Elisabeth Kremmer Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, Institute of Molecular Immunology, Munich, Germany Search for more papers by this author Steffen Roßner Steffen Roßner Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Leipzig, Germany Search for more papers by this author Stefan F Lichtenthaler Corresponding Author Stefan F Lichtenthaler Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Search for more papers by this author Author Information Peer-Hendrik Kuhn1,‡, Huanhuan Wang1,‡, Bastian Dislich1,2, Alessio Colombo1,2, Ulrike Zeitschel3, Joachim W Ellwart4, Elisabeth Kremmer4, Steffen Roßner3 and Stefan F Lichtenthaler 1,2 1Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany 2DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany 3Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Leipzig, Germany 4Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, Institute of Molecular Immunology, Munich, Germany ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding author. Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University, University of Munich, Munich 80336, Germany. Tel.: +49 89 218075453; Fax: +49 89 218075415; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2010)29:3020-3032https://doi.org/10.1038/emboj.2010.167 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The amyloid precursor protein (APP) undergoes constitutive shedding by a protease activity called α-secretase. This is considered an important mechanism preventing the generation of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide (Aβ). α-Secretase appears to be a metalloprotease of the ADAM family, but its identity remains to be established. Using a novel α-secretase-cleavage site-specific antibody, we found that RNAi-mediated knockdown of ADAM10, but surprisingly not of ADAM9 or 17, completely suppressed APP α-secretase cleavage in different cell lines and in primary murine neurons. Other proteases were not able to compensate for this loss of α-cleavage. This finding was further confirmed by mass-spectrometric detection of APP-cleavage fragments. Surprisingly, in different cell lines, the reduction of α-secretase cleavage was not paralleled by a corresponding increase in the Aβ-generating β-secretase cleavage, revealing that both proteases do not always compete for APP as a substrate. Instead, our data suggest a novel pathway for APP processing, in which ADAM10 can partially compete with γ-secretase for the cleavage of a C-terminal APP fragment generated by β-secretase. We conclude that ADAM10 is the physiologically relevant, constitutive α-secretase of APP. Introduction The amyloid precursor protein (APP) is one of a large number of membrane proteins that are proteolytically converted to their soluble counterparts. This process is referred to as ectodomain shedding and is an important way of regulating the biological activity of membrane proteins (Pruessmeyer and Ludwig, 2009; Reiss and Saftig, 2009). APP shedding occurs constitutively by two different protease activities, called α- and β-secretases, and leads to the secretion of soluble APP (APPs) (Figure 1A). Both proteolytic cleavages are central regulatory events in the generation of the amyloid-β peptide (Aβ), which has an important function in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD) (Selkoe and Schenk, 2003; Haass, 2004). The α- and β-secretases are assumed to compete for APP as a substrate (Selkoe and Schenk, 2003; Postina et al, 2004), but have opposite effects on Aβ generation. The β-secretase is the aspartyl protease BACE1 and cleaves APP at the N-terminus of the Aβ domain, thus catalysing the first step in Aβ generation (Vassar et al, 1999). In contrast, α-secretase cleaves within the Aβ sequence of APP (Esch et al, 1990), thereby precluding Aβ generation. In addition, α-secretase cleavage generates a secreted form of APP (APPsα), which has been reported to have neurotrophic and neuroprotective properties (Furukawa et al, 1996; Meziane et al, 1998; Stein et al, 2004), whereas the slightly shorter form (APPsβ) generated by β-secretase seems to have a proapoptotic function (Nikolaev et al, 2009). Figure 1.Characterization of newly generated APPsα-specific antibodies 4B4 and 7A6. (A) Schematic representation of APP. Indicated are the antibodies used in this study as well as antibody 6E10 and the APP-cleavage sites (with arrow heads) at the β-, β′- and α-secretases sites. Numbers below the sequence indicate the amino acids of the Aβ sequence. M, membrane. (B) Immunoblot of supernatants and cell lysates of cells expressing endogenous APP (Con) or transfected with the indicated constructs (APPwt, full-length APP; APPs, soluble APP lacking the transmembrane and cytoplasmic domain). Antibody 22C11 detects all secreted APP species, antibody W02 detects APPsα and APPsβ′, whereas antibodies 4B4 and 7A6 specifically detect APPsα (APPs-15 and APPs-16). (C) HEK293 cells were treated with the metalloprotease inhibitor TAPI-1 or the phorbol ester PMA. Immunoblots of conditioned media and cell lysates were probed with antibody 22C11 (APPs total), W02 (APPsα+β′) and the APPsα-specific antibody 4B4. Cellular APP is present in a lower molecular weight immature form (xx) and a higher molecular weight mature form (x) and was detected with 22C11. The β-actin blot serves as a loading control. The reduction by TAPI-1 and the increase in shedding by PMA are more pronounced when analysed with the α-cleavage-specific antibody 4B4, compared with the other antibodies. Download figure Download PowerPoint An increase of APP α-secretase cleavage is considered a therapeutic approach for AD (Fahrenholz, 2007), as it is assumed to reduce Aβ generation. However, the molecular identity of α-secretase is controversially discussed and remains to be fully established. Different metalloproteases were suggested as potential α-secretases, because their overexpression increased APP cleavage. The most frequently named ones are three members of the ADAM (a disintegrin and metalloprotease) family: ADAM9, 10 and 17 (Koike et al, 1999; Lammich et al, 1999; Slack et al, 2001). However, because the overexpression of a protease may artificially or indirectly increase APP α-secretase cleavage, the physiological relevance of a candidate protease needs to be shown using the corresponding protease knockdown or knockout cells. In fact, cells derived from ADAM9-, 10- or 17-deficient mice showed either no or a variable degree of reduction of APP shedding (Buxbaum et al, 1998; Hartmann et al, 2002; Weskamp et al, 2002). Likewise, RNAi-mediated knockdown of the individual proteases in cultured cells reduced APP shedding to different extents (Asai et al, 2003; Allinson et al, 2004; Camden et al, 2005; Freese et al, 2009; Taylor et al, 2009). The finding that APP shedding was never fully suppressed has led to the conclusion that ADAM9, 10 and 17 may all together contribute to α-secretase activity and that in the absence of one of them, the other proteases can still mediate APP α-secretase cleavage. This assumption is in clear contrast to other ADAM protease substrates, many of which are predominantly cleaved by a single ADAM protease, such as transforming growth factor α, epidermal growth factor (EGF), the low-affinity immunoglobulin E receptor CD23 and N-cadherin (Sahin et al, 2004; Reiss et al, 2005; Weskamp et al, 2006; Le Gall et al, 2009). One aspect that makes it difficult to study APP α-secretase cleavage is the fact that APP is cleaved by distinct proteases at different peptide bonds in close proximity. For example, β-secretase has the main cleavage site at the N-terminus of the Aβ sequence, but a secondary cleavage site (termed β′-site) within the Aβ sequence close to the α-secretase-cleavage site (Figure 1A). Antibodies used in previous studies have not only specifically detected APPsα, but also the alternative β-secretase-cleavage product APPsβ′ (Figure 1A), which may have confounded the study of α-secretase cleavage. Here, we systematically address the identity of the physiologically relevant α-secretase. We generated two new monoclonal antibodies specific for the APP α-secretase-cleavage product APPsα. Using these antibodies as well as mass spectrometry, we found that ADAM10, but not ADAM9 or 17, is essential for the constitutive α-secretase cleavage of APP. Results Generation of an APPsα-specific antibody To specifically detect the APP α-secretase-cleavage product APPsα, a new monoclonal antibody (4B4) was generated against a peptide comprising amino acids 11–16 of the Aβ sequence (Figure 1A). The peptide had a free C-terminus, mimicking the neoepitope generated upon α-secretase cleavage. Indeed, antibody 4B4 does not detect full-length APP in the cell lysate (Figure 1B). It specifically detects APPsα ending in amino acids 15 and 16 (APPs-15 and APPs-16), but does not detect shorter APPs species, including APPsβ′ and APPsβ (Figure 1B). In contrast, antibody W02 binds an epitope between the β- and the β′-cleavage sites and correspondingly detects both APPsα and APPsβ′, but not APPsβ. This antibody detects a similar epitope as antibody 6E10 that is frequently used for the detection of APPs (Miles et al, 2008). Antibody 22C11 binds to an N-terminal APP epitope and detects all APPs species tested (Figure 1B). All antibodies used specifically detect APP, because the antibodies do not detect a signal in APP knockdown cells (Supplementary Figure S1). To further validate antibody 4B4, we tested whether conditions, which increase or decrease APPsα generation, lead to a corresponding change in the 4B4 signal. To this aim, human embryonic kidney 293 cells (HEK293) expressing endogenous APP were treated with the metalloprotease inhibitor TAPI-1 to reduce APP shedding or with the phorbol ester PMA (also known as TPA) to increase APP shedding. Both compounds did not alter the expression of APP or actin in the cell lysate (Figure 1C). TAPI-1 inhibited nearly completely APPsα generation (4B4 blot). In contrast, total APPs shedding was not as strongly reduced (22C11 blot), consistent with the fact that this antibody detects all APPs species and not only APPsα. PMA strongly stimulated total APP shedding (22C11), but the extent of the increase was much more pronounced when specifically detecting APPsα (4B4). The strong increase in APP shedding was paralleled by a reduction of the mature APP in the cell lysate (Figure 1C, marked with x). Antibody W02, which detects APPsα+APPsβ′, detected intermediate changes between 22C11 and 4B4, in agreement with the antibody detecting both APPsβ′ and APPsα. In an additional control experiment, the β-secretase BACE1 was overexpressed, which is expected to increase β-secretase cleavage and to reduce α-secretase cleavage. BACE1 expression increased total APP shedding (22C11) in agreement with previous publications (Neumann et al, 2006; Schobel et al, 2006), but reduced as expected APPsα (4B4) (Supplementary Figure S2). Antibody W02 was not suited to detect the decrease in APPsα, because it also detects the alternative β-secretase-cleavage product APPsβ′, which was strongly enhanced upon overexpression of BACE1 (Supplementary Figure S2). Taken together, these experiments show that antibody 4B4 specifically detects APPsα, in contrast to other commonly used APP antibodies. Knockdown of ADAM9, 10 and 17 in HEK293 and SH-SY5Y cells Next, the three-candidate α-secretases ADAM9, 10 and 17 were transiently knocked down to evaluate their contribution to the constitutive α-secretase cleavage of endogenous APP in HEK293 and in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Compared with control-treated cells, the siRNA pools knocked down all three proteases with an efficiency of 75–90% (Figure 2A for HEK293; Figure 2D for SH-SY5Y; quantifications in Figure 2C and F). Levels of cellular APP as well as of the control membrane protein calnexin were not affected (Figure 2A and D). Knockdown of ADAM10 in HEK293 and SH-SY5Y cells reduced total APP shedding (22C11, normalized to cellular APP levels) to about 40% (Figure 2A, B, D and E), similar to the use of the metalloprotease inhibitor TAPI-1 (Figure 1C). In contrast, APPsα (4B4) was reduced to 10%, which corresponds to the remaining 10% of ADAM10 protease expressed in the knockdown cells. In contrast to ADAM10, the knockdown of ADAM9 did not significantly reduce total APPs or APPsα levels (Figure 2A, normalized to cellular APP levels). Knockdown of ADAM17 mildly reduced total APPs and APPsα in HEK293 cells (Figure 2A and B), but had no significant effect in SH-SY5Y cells (Figure 2C and D). The knockdown of either protease did not affect the expression level of the other proteases (Supplementary Figure S3). Taken together, expression of ADAM10, but not of ADAM9 or 17, is required for APP α-secretase cleavage. Moreover, ADAM9 and 17 did not compensate for the loss of ADAM10. Figure 2.Transient knockdown of ADAM10 suppresses α-secretase cleavage of endogenous APP. (A) HEK293 cells (293) were transfected with siRNA pools directed against the proteases ADAM9 (A9), ADAM10 (A10) or ADAM17 (A17) or with control siRNA. All three proteases were detected by western blot in membrane preparations. The mature active form is indicated with * (ADAM9), ** (ADAM10) and *** (ADAM17). The immature form of ADAM17 was also detected in HEK293 cells at a higher molecular weight. Calnexin was detected as a loading control. Cell lysates were analysed for cellular APP and conditioned media for total secreted APP (APPs total, 22C11, α+β′-cleaved APP (APPsα+β′, W02) and α-cleaved APP (APPsα, 4B4). (B, C) Quantification of experiments in (A). APPs total, APPsα+β′ and APPsα levels were normalized to cellular APP (B). Quantification of the protease knockdown (KD) efficiency is in (C). Given are mean and standard error of eight independent experiments relative (rel.) to control. (D) SH-SY5Y cells were treated as in (A). APP fragments were detected as in (A). The immature protease form was not visible for ADAM9, but is indicated with xx for ADAM10 and xxx for ADAM17, whereas the mature active form is indicated with * (ADAM9), ** (ADAM10) and *** (ADAM17). (E, F) Quantification of experiments in (D). Given are mean and standard error of eight independent experiments. Download figure Download PowerPoint To further validate the results from the transient knockdown of ADAM10, HEK293 cells (Figure 3) and SH-SY5Y cells (Figure 4) with a stable knockdown of ADAM10 were generated using lentiviruses expressing two different shRNA sequences against ADAM10 or a negative control shRNA. In HEK293 cells, both ADAM10 shRNA sequences (sh7, sh9) reduced ADAM10 protease levels and APPsα levels to 10–20% of controls (Figure 3A and B; quantification in Figure 3C–F), respectively, which is similar to the transient knockdown experiments. Similar results were obtained for the stable knockdown of ADAM10 in SH-SY5Y cells (Figure 4A and B). The remaining APPsα from the SH-SY5Y cells could be fully inhibited by addition of the metalloprotease inhibitor TAPI-1 (Figure 4A), which is in agreement with the remaining ∼10% of ADAM10 protease in the knockdown cells. The experiments in both cell lines show that also under stable knockdown conditions, ADAM10 is essential for APP α-secretase cleavage. Figure 3.Analysis of APP processing in HEK293 cells with a stable ADAM10 knockdown. (A, B) HEK293 cells were infected with lentiviral vectors carrying GFP and different shRNAs: a non-targeting shRNA (Con) and two different ADAM10-targeting shRNAs (sh7 and sh9). Conditioned media of these cells were analysed with antibody 22C11 (APPs total), W02 (APPsα+β′), 4B4 (APPsα), 192wt (APPsβ) or 2D8 (Aβ), whereas cell lysates were analysed for cellular APP (22C11). Membranes were analysed for ADAM10 protein. Calnexin was detected as a loading control. (C, D) Quantification of ADAM10 knockdown from experiments in (A, B) relative (rel.) to control. (E, F) Quantification of APP fragments in (A, B). Given are mean and standard error of four independent experiments. (G) HEK293 cells were lentivirally infected as in (A). with a non-targeting shRNA (Con) or two different BACE1-targeting shRNAs (B1-sh1, B1-sh2). APP and its processing products were analysed as in (A). Actin was used as a loading control. (H) Quantification of experiments in (G), carried out as in (E) and (F). Given are mean and standard error of three independent experiments. Download figure Download PowerPoint Figure 4.Analysis of APP processing in SH-SY5Y cells with a stable ADAM10 knockdown. (A) SH-SY5Y cells were infected with lentiviral vectors carrying GFP and different shRNAs: a non-targeting shRNA (Con) and two different ADAM10-targeting shRNAs (sh6 and sh9). Cells (Con, sh6 and sh9) were either treated with DMSO as solvent control or the metalloprotease inhibitor TAPI-1. Conditioned media of these cells were analysed with antibody 22C11 (APPs total), W02 (APPsα+β′) or 4B4 (APPsα), whereas cell lysates were analysed for cellular APP (22C11). Compared with HEK293 cells, the mature APP form is less well visible in SH-SY5Y cells. Membranes were analysed for ADAM10 protein. Calnexin was detected as a loading control. (B) Quantification of experiments in (A). APPs total, APPsα+β′ and APPsα were normalized to calnexin. Given are mean and standard error of four independent experiments. (C) Cells (Con, sh6 and sh9) were either treated with DMSO as solvent control or with the β-secretase inhibitor C3. Conditioned media of these cells were analysed as in (A). Antibody 192wt was used for the detection of APPsβ. (D) Quantification of experiments in (C), carried out as in (B) relative (rel.) to control. (E) Con and sh9 SH-SY5Y cells were treated with DMSO as a control or co-treated with the metalloprotease inhibitor TAPI-1 and the β-secretase inhibitor C3. (F) Quantification of experiments in (E), carried out as in (B). Given are mean and standard error of three independent experiments. Download figure Download PowerPoint α- and β-secretase cleavage do not compete for each other in HEK293 and SH-SY5Y cells Next, we analysed whether the reduction of APPsα was paralleled by an increase in APPsβ and Aβ generation. Surprisingly, however, this was not the case (Figure 3A and B; quantification in Figure 3E and F). Compared with control cells, endogenous APPsβ and Aβ levels in HEK293 cells were unchanged for one ADAM10 knockdown construct (sh9), whereas a mild, but not significant, increase was observed for the other shRNA construct (sh7) (Figure 3E and F). These results show that the strong reduction of α-cleavage does not yield a correspondingly increased cleavage by β-secretase. To further validate this finding, the opposite experiment was carried out. Expression of the β-secretase BACE1 was reduced by lentiviral knockdown constructs (sh1 and sh2). This resulted in a strong inhibition of APPsβ and Aβ generation, but not in a significant increase in APPsα generation (Figure 3G and H). Similar results were obtained for SH-SY5Y cells. The stable knockdown of ADAM10 did not increase APPsβ levels (Figure 4C and D) and conversely, the pharmacological inhibition of BACE1 with the specific inhibitor C3 (Stachel et al, 2004) did not increase APPsα levels (Figure 4C and D). Thus, we conclude that under constitutive cleavage conditions, α- and β-secretases do not significantly compete for APP as a substrate in HEK293 and SH-SY5Y cells. Contribution of α- and β-secretase cleavage to total APP secretion Total APP shedding (22C11) was reduced to ∼40% in the stable ADAM10 knockdown SH-SY5Y cells compared with controls (Figure 4C and D). Additional inhibition of BACE1 with the specific inhibitor C3 further reduced total APP secretion to ∼20%, revealing that BACE1 contributes about 20% to total APP secretion in the SH-SY5Y cells. This result also suggests that the remaining low level (<20%) of total APP secretion may result from proteases other than ADAM10 and BACE1. This was further confirmed by a combined pharmacological inhibition of α- and β-secretase cleavage in SH-SY5Y cells, which resulted in a remaining total APP secretion of 10–15% (Figure 4E and F). ADAM10 truncates APP C-terminal fragments C99 and C89 to C83 α- and β-secretases not only generate APPsα and APPsβ, but also the C-terminal fragments C83 and C99, respectively. Both fragments are further processed by γ-secretase, leading to a short half-life of the fragments, which makes it difficult to detect them at endogenous levels. Thus, we treated SH-SY5Y cells with the γ-secretase inhibitor DAPT, which stabilizes the endogenous C-terminal fragments of APP (Figure 5A). In control cells, the α-secretase fragment C83 was clearly detected (marked with ***) and was strongly reduced in the ADAM10 knockdown cells in parallel to APPsα (quantification in Figure 5B). To our surprise, the β-secretase-cleavage product C99 was increased more than two-fold upon ADAM10 knockdown (marked with *). In addition, a mild increase of C89 was observed (marked with **), which is the C-terminal fragment arising through BACE1 at its alternative β′-cleavage site (see Figure 1A for schematic drawing). The increase in C99 and C89 is in contrast to the APPsβ levels, which were unchanged upon ADAM10 knockdown (Figure 5B). We interpret this result in the following way. C99 and C89 can be processed in two pathways. The first one consists of cleavage by γ-secretase leading to Aβ generation, the second one occurs by α-secretase, leading to C83 generation. Upon ADAM10 knockdown, the latter pathway is blocked, leading to an increase in C99 and C89 and leaving APPsβ levels unchanged. Figure 5.Absence of ADAM10 reduces C83. (A) Left panels: SH-SY5Y cells were treated (+) or not (−) with the γ-secretase inhibitor DAPT to stabilize APP C-terminal fragments (CTFs). Endogenous CTFs were only visible upon DAPT treatment. Right panels: SH-SY5Y cells stably expressing ADAM10 shRNAs (sh7, sh9) or control shRNA (Con) were treated with DAPT. Conditioned media were analysed for APPsα (4B4) and APPsβ (192wt). Cell lysates were analysed for cellular APP, all C-terminal fragments (6687) and specifically C99 (2D8). C99 is marked with (*), C89 with (**) and C83 with (***). (B) Quantification of APPsα, APPsβ, C83 and C99 normalized to cellular APP relative (rel.) to control. Given are mean and standard error of four independent experiments. Download figure Download PowerPoint ADAM10 is required for α-secretase cleavage in primary neurons APP processing occurs in all cells and tissues analysed to date. However, in AD, APP processing is particularly relevant in the neurons of the central nervous system. Thus, we next investigated the contribution of ADAM9, 10 and 17 in α-secretase cleavage in primary murine cortical E16 neurons from C57/BL6 mice, expressing endogenous APP. Murine and human APP differ by three amino acids within the N-terminal half of the Aβ sequence. One of these amino-acid changes is within the peptide sequence used to generate the antibody 4B4. For this reason, we generated an additional antibody, called 7A6, which also detects the murine APPsα, but not APPsβ and APPsβ′ (Figure 1B). Using two different shRNA sequences, the lentiviral knockdown of ADAM10 reduced murine ADAM10 expression as well as murine APPsα to about 10–15% of the control (Figure 6A–C). This reveals that also in primary neurons, ADAM10 activity is required for APP α-secretase cleavage. As a control ADAM9 and 17 were also knocked down in the primary neurons. As both proteins could not be detected by immunoblot in the neuronal lysates, their expression was measured by quantitative RT–PCR (Figure 6F). Similar to the HEK293 and SH-SY5Y cells, knockdown of ADAM9 or 17 did not affect APP α-secretase cleavage (Figure 6D and E). Likewise expression of ADAM10 was not affected, as determined by both immunoblot (Figure 6D) and quantitative RT–PCR (Figure 6F). Together, these results show that both ADAM9 and 17 are not required for constitutive APP α-secretase cleavage in primary neurons. Figure 6.ADAM10 is essential for α-secretase cleavage of APP in primary cortical neurons. (A) Primary cortical neurons were prepared at E16 from C57/BL6 mice and infected with purified lentiviral particles carrying GFP and either a non-targeting control shRNA (Con) or two distinct murine ADAM10-targeting shRNAs (sh-I, sh-II). Four days before harvest, the medium was changed. Media were analysed for total secreted APP (antibody 22C11), APPsα (7A6) and APPsβ (BAWT). Cell lysates were analysed for cellular APP, ADAM10 and β-actin (loading control). Immature ADAM10 is indicated with (*) and mature ADAM10 with (**). Protein levels of ADAM10 were reduced by both shRNAs to about 10% of control (not shown). (B) Quantification of total secreted APP, APPsβ and APPsα, relative (rel.) to control. Aβ was measured by ELISA. Given are mean and standard error of eight independent experiments. (C) Quantitative RT–PCR shows that ADAM10 mRNA levels are strongly reduced, whereas levels of ADAM9 and 17 mRNA were not affected. Given are mean and standard error of four independent experiments. (D) Lentiviral knockdown of ADAM9 and 17 in primary neurons was carried out as in (A). (E) Quantification of results in (D) was performed as in (B). Both knockdowns did not affect APP processing. Given are mean and standard error of five independent experiments. (F) Quantitative RT–PCR shows efficient knockdown of ADAM9 and 17, whereas ADAM10 levels were not affected. Knockdown of ADAM17 partially reduced ADAM9 mRNA levels. Given are mean and standard error of four independent experiments. Download figure Download PowerPoint Interestingly, total APP secretion (22C11) was only mildly reduced in the ADAM10 knockdown neurons, which is most likely due to the fact that in primary embryonic neurons, α-secretase cleavage contributes only to a smaller extent to total APP secretion, compared with cell lines (Simons et al, 1996) (Figure 6A). Indeed, β-secretase expression is particularly high during embryonic development and in the first 2 weeks after birth, but then drops sharply (Willem et al, 2006). In contrast to the HEK293 and SH-SY5Y cell

Abstract ATP has been indicated as a primary factor in microglial response to brain injury and inflammation. By acting on different purinergic receptors 2, ATP is known to induce chemotaxis and stimulate the release of several cytokines from these cells. The activation of purinergic receptors 2 in microglia can be triggered either by ATP deriving from dying cells, at sites of brain injury or by ATP released from astrocytes, in the absence of cell damage. By the use of a biochemical approach integrated with video microscopy experiments, we investigated the functional consequences triggered in microglia by ATP released from mechanically stimulated astrocytes, in mixed glial cocultures. Astrocyte-derived ATP induced in nearby microglia the formation and the shedding of membrane vesicles. Vesicle formation was inhibited by the ATP-degrading enzyme apyrase or by P2X7R antagonists. Isolation of shed vesicles, followed by IL-1β evaluation by a specific ELISA revealed the presence of the cytokine inside the vesicular organelles and its subsequent efflux into the extracellular medium. IL-1β efflux from shed vesicles was enhanced by ATP stimulation and inhibited by pretreatment with the P2X7 antagonist oxidized ATP, thus indicating a crucial involvement of the pore-forming P2X7R in the release of the cytokine. Our data identify astrocyte-derived ATP as the endogenous factor responsible for microvesicle shedding in microglia and reveal the mechanisms by which astrocyte-derived ATP triggers IL-1β release from these cells.

Coding variants in the triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) are associated with late-onset Alzheimer's disease (AD). We demonstrate that amyloid plaque seeding is increased in the absence of functional Trem2. Increased seeding is accompanied by decreased microglial clustering around newly seeded plaques and reduced plaque-associated apolipoprotein E (ApoE). Reduced ApoE deposition in plaques is also observed in brains of AD patients carrying TREM2 coding variants. Proteomic analyses and microglia depletion experiments revealed microglia as one origin of plaque-associated ApoE. Longitudinal amyloid small animal positron emission tomography demonstrates accelerated amyloidogenesis in Trem2 loss-of-function mutants at early stages, which progressed at a lower rate with aging. These findings suggest that in the absence of functional Trem2, early amyloidogenesis is accelerated due to reduced phagocytic clearance of amyloid seeds despite reduced plaque-associated ApoE.

Article22 June 2012free access Secretome protein enrichment identifies physiological BACE1 protease substrates in neurons Peer-Hendrik Kuhn Peer-Hendrik Kuhn DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Katarzyna Koroniak Katarzyna Koroniak Karlsruhe Institute of Technology (KIT), Institute of Organic Chemistry (IOC), Karlsruhe, Germany Search for more papers by this author Sebastian Hogl Sebastian Hogl Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Alessio Colombo Alessio Colombo DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Search for more papers by this author Ulrike Zeitschel Ulrike Zeitschel Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Leipzig, Germany Search for more papers by this author Michael Willem Michael Willem Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Christiane Volbracht Christiane Volbracht Department of Molecular Neurobiology, H. Lundbeck, Valby, Denmark Search for more papers by this author Ute Schepers Ute Schepers KIT, Institute for Toxicology and Genetics (ITG), Eggenstein-Leopoldshafen, Germany Search for more papers by this author Axel Imhof Axel Imhof Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Albrecht Hoffmeister Albrecht Hoffmeister Division of Gastroenterology and Rheumatology, Department of Medicine and Dermatology, University of Leipzig, Leipzig, Germany Search for more papers by this author Christian Haass Christian Haass DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Steffen Roßner Steffen Roßner Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Leipzig, Germany Search for more papers by this author Stefan Bräse Stefan Bräse Karlsruhe Institute of Technology (KIT), Institute of Organic Chemistry (IOC), Karlsruhe, Germany Search for more papers by this author Stefan F Lichtenthaler Corresponding Author Stefan F Lichtenthaler DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Technical University of Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Peer-Hendrik Kuhn Peer-Hendrik Kuhn DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Katarzyna Koroniak Katarzyna Koroniak Karlsruhe Institute of Technology (KIT), Institute of Organic Chemistry (IOC), Karlsruhe, Germany Search for more papers by this author Sebastian Hogl Sebastian Hogl Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Alessio Colombo Alessio Colombo DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Search for more papers by this author Ulrike Zeitschel Ulrike Zeitschel Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Leipzig, Germany Search for more papers by this author Michael Willem Michael Willem Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Christiane Volbracht Christiane Volbracht Department of Molecular Neurobiology, H. Lundbeck, Valby, Denmark Search for more papers by this author Ute Schepers Ute Schepers KIT, Institute for Toxicology and Genetics (ITG), Eggenstein-Leopoldshafen, Germany Search for more papers by this author Axel Imhof Axel Imhof Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Albrecht Hoffmeister Albrecht Hoffmeister Division of Gastroenterology and Rheumatology, Department of Medicine and Dermatology, University of Leipzig, Leipzig, Germany Search for more papers by this author Christian Haass Christian Haass DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Search for more papers by this author Steffen Roßner Steffen Roßner Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Leipzig, Germany Search for more papers by this author Stefan Bräse Stefan Bräse Karlsruhe Institute of Technology (KIT), Institute of Organic Chemistry (IOC), Karlsruhe, Germany Search for more papers by this author Stefan F Lichtenthaler Corresponding Author Stefan F Lichtenthaler DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany Technical University of Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Author Information Peer-Hendrik Kuhn1,2, Katarzyna Koroniak3, Sebastian Hogl2, Alessio Colombo1, Ulrike Zeitschel4, Michael Willem2, Christiane Volbracht5, Ute Schepers6, Axel Imhof2, Albrecht Hoffmeister7, Christian Haass1,2, Steffen Roßner4, Stefan Bräse3 and Stefan F Lichtenthaler 1,2,8 1DZNE—German Center for Neurodegenerative Diseases, Munich, Germany 2Biochemistry, Adolf-Butenandt-Institute, Ludwig-Maximilians-University, Munich, Germany 3Karlsruhe Institute of Technology (KIT), Institute of Organic Chemistry (IOC), Karlsruhe, Germany 4Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Leipzig, Germany 5Department of Molecular Neurobiology, H. Lundbeck, Valby, Denmark 6KIT, Institute for Toxicology and Genetics (ITG), Eggenstein-Leopoldshafen, Germany 7Division of Gastroenterology and Rheumatology, Department of Medicine and Dermatology, University of Leipzig, Leipzig, Germany 8Technical University of Munich, Munich, Germany *Corresponding author. DZNE and Technical University Munich, Munich 80336, Germany. Tel.:+49 89 218075453; Fax:+49 89 218075415; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2012)31:3157-3168https://doi.org/10.1038/emboj.2012.173 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Cell surface proteolysis is essential for communication between cells and results in the shedding of membrane-protein ectodomains. However, physiological substrates of the contributing proteases are largely unknown. We developed the secretome protein enrichment with click sugars (SPECS) method, which allows proteome-wide identification of shedding substrates and secreted proteins from primary cells, even in the presence of serum proteins. SPECS combines metabolic glycan labelling and click chemistry-mediated biotinylation and distinguishes between cellular and serum proteins. SPECS identified 34, mostly novel substrates of the Alzheimer protease BACE1 in primary neurons, making BACE1 a major sheddase in the nervous system. Selected BACE1 substrates—seizure-protein 6, L1, CHL1 and contactin-2—were validated in brains of BACE1 inhibitor-treated and BACE1 knock-out mice. For some substrates, BACE1 was the major sheddase, whereas for other substrates additional proteases contributed to total substrate shedding. The new substrates point to a central function of BACE1 in neurite outgrowth and synapse formation. SPECS is also suitable for quantitative secretome analyses of primary cells and may be used for the discovery of biomarkers secreted from tumour or stem cells. Introduction Proteolysis is an irreversible post-translational modification mediated by over 500 different proteases in man. Proteases control the function or mediate the degradation of virtually all proteins in the cell, but the biological functions of many proteases are unknown, because no or only few physiological substrates have been identified. This is particularly true for a large class of membrane-bound proteases, referred to as sheddases, which mostly cleave single-span membrane proteins at the extracellular surface of cellular membranes. This process is termed as ectodomain shedding and is essential for the communication between cells (Reiss and Saftig, 2009; Bai and Pfaff, 2011; Lichtenthaler et al, 2011). Shedding is involved in various physiological and pathophysiological conditions, including Alzheimer's disease. One of the sheddases is the aspartyl protease BACE1 (β-secretase), which is a key drug target for Alzheimer's disease, as it mediates the shedding of amyloid precursor protein (APP) and catalyses the first step in the generation of the pathogenic Aβ peptide (Vassar et al, 2009). Possible side effects of BACE1 inhibition in patients may result from a reduced cleavage of additional, largely unknown physiological BACE1 substrates. Besides APP, BACE1 also cleaves neuregulin-1 and contributes to myelination in the peripheral nervous system (Hu et al, 2006; Willem et al, 2006). Additionally, several new phenotypes of BACE1-deficient mice were reported recently, such as schizophrenic symptoms, increased mortality, epileptic seizures, hyperactivity, anxiety, impaired axon guidance and protection against diet-induced obesity (Harrison et al, 2003; Dominguez et al, 2005; Laird et al, 2005; Savonenko et al, 2008; Wang et al, 2008; Hu et al, 2010; Farah et al, 2011; Meakin et al, 2011; Rajapaksha et al, 2011). These phenotypes mostly affect brain and pancreas, where BACE1 expression is highest (Vassar et al, 1999), but it remains unclear which substrates are affected in these tissues. The secretome of a cell comprises soluble, secreted proteins and the membrane protein ectodomains proteolytically released by sheddases (sheddome). Proteomic identification of secretome proteins from the conditioned medium of cells is in principle possible by mass spectrometry, but has been difficult due to three fundamental limitations (Makridakis and Vlahou, 2010). First, secretome proteins have low concentrations in conditioned media. Second, the use of media supplements such as fetal calf serum or the neuronal supplement B27 introduces albumin and other serum proteins at concentrations (up to 5 g/l) much higher than the secretome proteins (Price and Brewer, 2001). Third, secretome proteins can be masked by highly abundant cytosolic proteins released from broken or apoptotic cells. Thus, the mass spectrometer used for protein identification predominantly identifies albumin, other serum proteins and cytosolic proteins, but not the cell-derived secretome proteins. To circumvent these limitations, previous studies used serum- or protein-free cell culture conditions. However, cellular stress and incompatibility with the culture of many cell types are major drawbacks of this approach, making identification and quantification of secreted proteins in primary cells, such as neurons, impossible. Additionally, many sheddases are less active in the absence of serum. As a consequence, the desired protease is frequently overexpressed or added exogenously in vitro, as carried out for example for BACE1, meprin β and MT1-MMP (Tam et al, 2004; Hemming et al, 2009; Jefferson et al, 2011). While this type of approach can demonstrate which substrates may in principle be cleaved by a protease, false positive substrate identification is a major risk of protease overexpression, for example because of mislocalization of the protease (Huse et al, 2002). Here, we developed a novel technique for quantitative proteomics of cell culture supernatants containing serum or albumin, called secretome protein enrichment with click sugars (SPECS), which solves the challenges mentioned above. SPECS distinguishes between secretome proteins and exogenous serum proteins within the conditioned medium. We used SPECS to determine the secretome of human embryonic kidney 293 (HEK293T) cells and of primary, murine neurons in the presence of serum proteins. Additionally, SPECS was used to identify novel, physiological BACE1 substrates in primary neurons. Selected BACE1 substrates—seizure-protein 6, L1, CHL1 and contactin-2—were validated in brains of BACE1 inhibitor-treated and BACE1 knock-out mice. Results Development of the SPECS method SPECS exploits the fact that the majority of secreted proteins (66%) and potential shedding substrates (87% of type I and type II transmembrane proteins) is glycosylated as annotated in Uniprot. SPECS consists of metabolic labelling of cellular glycoproteins with azido sugars followed by copper-free click chemistry-mediated biotinylation of cellular, but not of serum glycoproteins (Figure 1A). The click-chemistry reaction consists of the bioorthogonal, chemical [3+2] cycloaddition of an azide moiety with a strained cycloalkyne (Jewett and Bertozzi, 2010). We used the biotinylated, strained cycloalkyne dibenzylcyclooctyne (DBCO-PEG12-biotin) (Figure 1B) and tetraacetyl-N-azidoacetyl-mannosamine (ManNAz), which is metabolically converted to N-azidoacetyl-sialic acid and incorporated into terminal positions in N- and O-linked glycans (Sletten and Bertozzi, 2011). Due to the lack of an active transport of N-acetylamino sugars across the plasma membrane of mammalian cells, the hydroxy-groups of the sugar are peracetylated to permit passive diffusion of the sugars into the cytosol, where the acetyl groups are cleaved off by cellular esterases. Figure 1.Overview and validation of SPECS method. (A) Detailed description of the work flow of the SPECS method including a timeline. (B) Schematic representation of the click reaction between the azide group (blue) of 1,3,4,6-acetyl-N-acetyl-azido-mannosamine (ManNAz) and the strained alkyne (red) of dibenzylcycloocytne-PEG12-Biotin. (C) APP and APLP2 shedding were analysed in the presence of the BACE1 inhibitor C3 and ManNAz or DMSO as a control. Subsequently, click-chemistry reaction was performed in the conditioned medium. Full-length APP (APPfl) and APLP2 (APLP2fl) in the lysates as well as secreted APP and APLP2 (sAPPtotal, sAPPβ, sAPLP2) were detected by immunoblot. The analysis shows no significant changes of the shedding of APP and APLP2 upon addition of ManNAz. Biotinylated proteins (specific bands and broad smear) were detected with Streptavidin-HRP only when ManNAz was present. Acetylated (Ac) tubulin serves as a loading control. (D) Purification of glycoproteins by streptavidin pull down after click-chemistry reaction. Left: aliquot of conditioned medium is directly loaded (input). Right: upon streptavidin pull down, sAPPtotal is enriched by about two-fold, whereas serum albumin in the coomassie gel is reduced over 50-fold, leading to a specific enrichment of the glycosylated sAPPtotal by over 100-fold. (E) Distribution of glycoprotein types among all glycoproteins identified in the HEK293T (293T) secretome and the neuronal secretome. Only such proteins were included, which were detected by at least two peptides. Detailed listing of identified proteins and their topology is in Supplementary Tables 1, 2, 5 and 6. Download figure Download PowerPoint After ManNAz labelling the conditioned medium contained the labelled ectodomains released by shedding together with cell-derived secreted proteins (Figure 1A). Free ManNAz was removed by ultrafiltration followed by in-vitro click reaction, resulting in biotinylation of secretome proteins (Figure 1A). Subsequent ultrafiltration removed excessive biotinylated cyclooctyne. After streptavidin pull down, the protein samples were separated by SDS–PAGE, followed by in-gel trypsinization. The resulting peptides were analysed by nanoLC coupled to high-resolution mass spectrometry. Peptide identification was done by Andromeda. The SPECS method can be carried out with little hands-on time within 6 days, which includes 2 days of metabolic sugar labelling and 2 days of mass spectrometric analysis. To exclude any interference of metabolic glycan labelling with cellular physiology, we investigated in primary neurons the known shedding of the APP and its homologue, the amyloid precursor-like protein 2 (APLP2), by the protease BACE1, which is a main drug target in Alzheimer's disease (Vassar et al, 2009) and is also involved in myelination (Hu et al, 2006; Willem et al, 2006). The presence of ManNAz neither altered shedding of APP and APLP2 or its response to the specific BACE1 inhibitor C3 (Stachel et al, 2004; Figure 1C) nor did it affect neuronal viability, in agreement with a previous study (Almaraz et al, 2012). Secreted APP (sAPPtotal) was enriched by over 100-fold relative to albumin (Figure 1D). These results demonstrate that SPECS works successfully and is compatible with primary cells, such as neurons. Determination of cellular secretomes and sheddomes Next, we used SPECS to determine the secretome of neurons and of HEK293T cells, an immortalized cell line. HEK293T cells were grown in the presence of serum with or without ManNAz. In all, 254 proteins were specifically identified in the presence but not in the absence of ManNAz and constitute the secretome of HEK293T cells. The secretome comprised 142 membrane protein ectodomains, which constitute the sheddome, and 112 secreted proteins (Figure 1E; Supplementary Tables 1, 2, 3 and 4). To determine the neuronal secretome, primary E15/E16 wild-type neurons were cultured in the presence of ManNAz. Additionally, the neurons were incubated with or without the BACE1 inhibitor C3 to determine which of the secretome proteins are BACE1 substrates (next paragraph). Relative label-free protein quantification of identified unique protein groups was performed using the MaxQuant software suite. In all, 427 glycoproteins were identified in total, with 283 of them being identified in at least four out of five experiments without inhibitor. These 283 proteins comprise 97 secreted proteins and 186 shed membrane proteins (sheddome) and constitute the secretome of primary neurons (Figure 1E; Supplementary Tables 5 and 6, raw data and peptides are given in Supplementary Tables 7 and 8). While a previous study identified 34 proteins as the neuronal secretome using serum-free conditions (Thouvenot et al, 2008), SPECS identified 283 proteins with high sequence coverage, demonstrating the advantage of the SPECS method. It is possible that neurons and HEK293T cells secrete additional proteins, in particular low-abundant proteins below the detection limit of the SPECS method or proteins with a molecular mass <30 kDa, which would be lost during the filtration steps of the SPECS method. However, smaller molecular mass cut-off columns may also be used, which would allow detection of small-sized glycosylated secretome proteins. In all, 112 proteins of the neuronal secretome (47%) were shared with the HEK293T cell secretome, whereas the remaining proteins include many proteins with neuronal functions, such as neuroligins and LINGO-1 (Supplementary Table 5). Identification of neuronal BACE1 sheddome While the majority of the neuronal secretome was not affected by C3 treatment, 40 proteins showed a reduced shedding or secretion (Table I, top part). Proteins were included into this hit list, if their levels were quantifiable in at least four out of the five biological replicates and had a variance score ≤0.35 in the C3-treated samples. The 40 proteins include 34 membrane proteins (Table I), which we refer to as the neuronal BACE1 substrates (BACE1 sheddome), even though it remains possible that the shedding of some substrates may have been reduced indirectly. In all, 8 of the 34 proteins had previously been identified as candidate substrates in BACE1 overexpressing cells (Hemming et al, 2009). The 23 remaining proteins besides APP and its homologues are novel BACE1 substrates. Table 1. Changes in protein secretion and shedding upon BACE1 inhibitor C3 treatment Protein name IPIa Meanb s.e.m.c VSd Pepte Protein typef Membrane proteins showing reduced shedding upon C3 treatment Seizure protein 6-like 1 IPI00674241 0.04 0.01 1.28E−02 13 Type I Seizure protein 6 IPI00380749 0.08 0.03 3.08E−02 19 Type I Amyloid precursor-like protein 1 IPI00129249 0.11 0.02 2.32E−02 27 Type I VWFA and cache domain-containing protein 1 IPI00350425 0.12 0.12 1.31E−01 6 Type I Golgi apparatus protein 1 IPI00122399 0.21 0.05 6.69E−02 11 Type I L1 IPI00785371 0.21 0.03 3.79E−02 24 Type I Leucine-rich repeat neuronal protein 1 IPI00126070 0.25 0.06 7.69E−02 7 Type I Plexin domain-containing protein 2 IPI00471179 0.25 0.10 1.38E−01 3 Type I Neurotrimin IPI00417005 0.33 0.14 2.08E−01 6 GPI Cell adhesion molecule with homology to L1CAM IPI00831546 0.35 0.05 7.25E−02 49 Type I Peptidyl-glycine α-amidating monooxygenase IPI00323974 0.36 0.12 1.83E−01 23 Type I Alpha-1,4-N-acetylhexosaminyltransferase EXTL2 IPI00112900 0.36 0.16 2.47E−01 5 Type II Protocadherin γ A11 IPI00129686 0.42 0.15 2.56E−01 7 Type I Amyloid precursor-like Protein 2 IPI00121338 0.43 0.09 1.57E−01 20 Type I ST3GAL-I sialyltransferase IPI00108849 0.44 0.17 2.98E−01 3 Type II Latrophilin-1 IPI00918724 0.45 0.10 1.79E−01 19 Polytopic Neuroligin 4 IPI00858277 0.45 0.08 1.38E−01 22 Type I Semaphorin-6D IPI00396759 0.47 0.09 1.70E−01 3 Type I Lysosomal membrane glycoprotein 1 IPI00469218 0.48 0.16 3.14E−01 2 Type I Neurexin I-α IPI00468539 0.51 0.04 7.94E−02 30 Type I Protocadherin-20 IPI00222278 0.52 0.16 3.22E−01 10 Type I Latrophilin-3 IPI00411157 0.53 0.10 2.09E−01 7 Polytopic Latrophilin-2 IPI00876558 0.56 0.10 2.17E−01 10 Polytopic Sodium/potassium-dependent ATPase subunit β-1 IPI00121550 0.57 0.14 3.33E−01 3 Type II Delta and Notch-like epidermal growth factor-related receptor IPI00170342 0.57 0.09 2.19E−01 3 Type I Interferon α/β receptor 2 IPI00395209 0.58 0.12 2.84E−01 4 Type I Neuroligin-2 IPI00468605 0.58 0.11 2.55E−01 16 Type I Seizure 6-like protein 2 IPI00128454 0.60 0.14 3.41E−01 13 Type I Leucine-rich repeat and fibronectin type-III domain-containing protein 2 IPI00330152 0.62 0.13 3.37E−01 4 Type I CX3C membrane-anchored chemokine IPI00127811 0.64 0.11 2.97E−01 4 Type I Contactin-2 IPI00119970 0.64 0.06 1.81E−01 39 GPI Amyloid precursor protein IPI00114389 0.67 0.08 2.44E−01 30 Type I Neuroligin-1 IPI00309113 0.73 0.08 2.86E−01 13 Type I Transmembrane protein 132A IPI00464151 0.82 0.06 3.45E−01 38 Type I Soluble proteins reduced upon C3 treatment Activin β-B chain IPI00355134 0.14 0.08 8.87E−02 7 Secreted Adamts3 IPI00672899 0.30 0.18 2.53E−01 7 Secreted Insulin-like growth factor-binding protein 2 IPI00313327 0.41 0.12 2.10E−01 2 Secreted Extracellular matrix protein 1 IPI00889948 0.49 0.13 2.63E−01 5 Secreted Neuronal olfactomedin-related ER localized protein IPI00136712 0.50 0.12 2.28E−01 10 Secreted Reelin IPI00121421 0.85 0.04 2.87E−01 21 Secreted Selection of proteins unaltered upon C3 treatment Hepatocyte growth factor receptor IPI00130420 0.83 0.13 7.60E−01 8 Type I Neogenin IPI00129159 0.90 0.09 8.56E−01 33 Type I Protocadherin-γ C3 IPI00129613 0.81 0.13 6.86E−01 12 Type I Receptor-type tyrosine-protein phosphatase sigma IPI00230067 0.90 0.19 1.90E+00 20 Type I Leucine-rich repeat-containing protein 4B IPI00381059 0.91 0.18 2.13E+00 20 Type I Netrin receptor DCC IPI00137347 1.00 0.18 1.38E+02 31 Type I Prostaglandin F2 receptor-negative regulator IPI00515319 0.85 0.15 1.04E+00 29 Type I Neural cell adhesion molecule 1 IPI00122971 0.99 0.16 1.12E+01 28 Type I a IPI accession number of the protein. b Mean ratio between BACE1 inhibitor treatment (C3) and control (DMSO) conditions of the summed unique peptides intensities identified for a unique protein group for five biological replicates (C3/DMSO) shows remaining ectodomain levels upon BACE1 inhibition. SPECS values for remaining shedding of APP (0.67=67%), APLP1 (0.11=11%) and APLP2 (0.42=42%) correspond well to the literature. In neurons, APLP1 is mainly cleaved by BACE1 (Sala Frigerio et al, 2010), whereas APLP2 shedding is mediated to about 60% by BACE1 (Hogl et al, 2011). In contrast, total APP shedding was only mildly inhibited with C3, because it is known that inhibition of BACE1 cleavage of APP is accompanied by an increase in the ADAM10-mediated cleavage, resulting in only a moderate inhibition of total APP shedding upon BACE1 inhibition (Vassar et al, 1999; May et al, 2011). c Standard error of the mean for five biological replicates. d Variance score was calculated for all proteins. Proteins with a variance score of ≤0.35 were considered as proteins with a consistent change under BACE1 inhibition. e Number of identified peptides of the protein group. f Protein type: Secreted: Secreted, soluble protein, Type I: type I membrane protein, Type II: type II membrane protein, Polytopic: membrane protein with multiple transmembrane domains, GPI: GPI-anchored membrane protein. The protein list of BACE1 substrates includes APP and its homologues APLP1 and APLP2 (Table I), which are all three known BACE1 substrates and validate the SPECS analysis. Importantly, the extent to which the shedding of APP and its homologues was reduced (Table I) corresponds well to previous results obtained by quantitative immunoblots in neurons or brain (Vassar et al, 1999; Sala Frigerio et al, 2010; Hogl et al, 2011; May et al, 2011). For example, total APP shedding was only mildly inhibited with C3, because inhibition of BACE1 cleavage of APP has been shown to be accompanied by an increase in the ADAM10-mediated cleavage, resulting in only a moderate inhibition of total APP shedding upon BACE1 inhibition (Vassar et al, 1999; May et al, 2011). These results demonstrate that SPECS is well suited for the quantitative analysis of protein shedding. For other proteins on the BACE1 sheddome list shedding was reduced by about 20% (transmembrane protein 132A) to over 95% (seizure 6-like protein) (Table I, top part), suggesting that for some substrates (transmembrane protein 132A) BACE1 only contributes to a small extent to total shedding, whereas other substrates are nearly exclusively cleaved by BACE1 in neurons. Peptides identified from individual membrane proteins were exclusively derived from their ectodomains (Supplementary Figure 1A, shown in yellow), indicating that they derive from true ectodomain shedding and not from full-length proteins released by broken cells. Additionally, for three BACE1 substrates (APP, APLP1, seizure 6-like protein 1 (SEZ6L1)) semi-tryptic peptides were identified (Supplementary Figure 1A, shown in green), which were reduced after BACE1 inhibition (Supplementary Figure 1B), suggesting that they derive from direct BACE1 cleavage. Indeed, the peptide from APP corresponds exactly to the known BACE1 cleavage site (Supplementary Figure 1B) and demonstrates that SPECS allows cleavage site determination. Six of the forty proteins were soluble proteins and showed an inhibition of secretion by about 20–90% (Table I, middle part), including the TGFβ superfamily member activin β and insulin-like growth factor-binding protein 2. Because these are known soluble proteins, their reduced secretion is likely to be a secondary consequence of BACE1 inhibition. However, they may be useful as diagnostic markers to monitor the efficacy of BACE1 inhibitors in Alzheimer's patients. Validation of BACE1 substrates in primary neurons To further validate the SPECS data, the shedding inhibition by C3 was analysed in the absence of ManNAz and quantified by immunoblot for four novel BACE1 substrates besides APP, APLP1 and APLP2. For most of the novel substrates, no antibodies are available which allow detection of the endogenous, shed ectodomain by immunoblot. We chose four proteins, where suitable antibodies were available and which showed mild, moderate and strong shedding inhibition by C3 in the SPECS measurement (Table I, top part). The quantitative comparison of SPECS and immunoblots yielded the following shedding inhibition upon C3 treatment: 12.3/7.8% (SPECS/immunoblot) for seizure protein 6 (SEZ6) (Figure 2A and quantification in Figure 2B); 23/21% for cell adhesion protein L1; 49/35% for close homologue of L1 (CHL1); 56/64% for contactin-2, a GPI-anchored protein. The values obtained by immunoblots were similar to the SPECS measurements and demonstrate the quantitative accuracy of SPECS. The reduced shedding was accompanied by increased levels of the full-length proteins in the cell lysate (Figure 2A and quantification in Figure 2B), showing that C3 reduced substrate shedding and not simply substrate expression. Interestingly, a strong reduction in shedding was not always accompanied by a strong increase in full-length protein levels in the lysate, suggesting that additional cellular mechanisms besides shedding control the full-length protein levels. Figure 2.Validation of BACE1 substrates in primary neurons. (A) Primary neurons were treated with DMSO or with the BACE1 inhibitor C3 overnight. Sez6, CHL1, L1 and contactin-2 showed reduced shedding into the cell supernatant (Sup) and accumulation of their membrane-tethered precursors in the lysate (Lys) after treatment with C3. The specific BACE1 cleavage produc

Abstract Previous studies have identified a crucial role of the gut microbiome in modifying Alzheimer’s disease (AD) progression. However, the mechanisms of microbiome-brain interaction in AD, including the microbial mediators and their cellular targets in the brain, were so far unknown. Here, we identify microbiota-derived short chain fatty acids (SCFA) as key metabolites along the gut-brain axis in AD. Germ-free (GF) AD mice exhibit a substantially reduced Aβ plaque load and markedly reduced SCFA plasma concentrations; conversely, SCFA supplementation to GF AD mice was sufficient to increase the Aβ plaque load to levels of conventionally colonized animals. While Aβ generation was only mildly affected, we observed strong microglial activation and upregulation of ApoE upon the SCFA supplementation. Taken together, our results demonstrate that microbiota-derived SCFA are the key mediators along the gut-brain axis resulting in increased microglial activation, ApoE upregulation and Aβ deposition.

Microglial dysfunction is a key pathological feature of Alzheimers disease (AD), but little is known about proteome-wide changes in microglia during the course of AD pathogenesis and their functional consequences. Here, we performed an in-depth and time-resolved proteomic characterization of microglia in two mouse models of amyloid Aβ pathology, the overexpression APPPS1 and the knock-in APP-NL-G-F (APP-KI) model. We identified a large panel of Microglial Aβ Response Proteins (MARPs) that reflect a heterogeneity of microglial alterations during early, middle and advanced stages of Aβ deposition. Although both mouse models display severe microglial alterations at late stages of amyloid pathology, MARP signatures occur earlier in the APPPS1 mice. Strikingly, the kinetic differences in proteomic profiles correlated with the presence of fibrillar Aβ rather than dystrophic neurites, suggesting that fibrillar Aβ aggregates are the main drivers of the AD-associated microglial phenotype and the observed functional decline. The identified microglial proteomic fingerprints of AD provide a valuable resource for functional studies of novel molecular targets and potential biomarkers for monitoring AD progression or therapeutic efficacy.

Background: Microglia are the primary brain cell type regulating neuroinflammation and they are important for healthy aging. Genes regulating microglial function are associated with an increased risk of neurodegenerative disease. Loss-of-function mutations in CLN3, which encodes an endolysosomal membrane protein, lead to the most common childhood-onset form of neurodegeneration, featuring early-stage neuroinflammation that long precedes neuronal cell loss. How loss of CLN3 function leads to this early neuroinflammation is not yet understood. Methods: Here, we have comprehensively studied microglia from Cln3∆ex7/8 mice, a genetically accurate CLN3 disease model. Microglia were isolated from young and old Cln3∆ex7/8 mice for downstream molecular and functional studies. Results: We show that loss of CLN3 function in microglia leads to classic age-dependent CLN3-disease lysosomal storage as well as an altered morphology of the lysosome, mitochonodria and Golgi compartments. Consistent with these morphological alterations, we also discovered pathological proteomic signatures implicating defects in lysosomal function and lipid metabolism processes at an early disease stage. CLN3-deficient microglia were unable to efficiently turnover myelin and metabolize its associated lipids, showing severe defects in lipid droplet formation and significant accumulation of cholesterol, phenotypes that were corrected by treatment with autophagy inducers and cholesterol lowering drugs. Finally, we observed reduced myelination in aging homozygous Cln3∆ex7/8 mice suggesting altered myelin turnover by microglia impacts myelination in the CLN3-deficient brain. Conclusion: Our results implicate a cell autonomous defect in CLN3-deficient microglia that impacts the ability of these cells to support neuronal cell health. These results strongly suggest microglial targeted therapies should be considered for CLN3 disease.

Niemann-Pick type C disease is a rare neurodegenerative disorder mainly caused by mutations in Npc1 , resulting in abnormal late endosomal/lysosomal lipid storage. Although microgliosis is a prominent pathological feature, consequences of NPC1 loss on microglial function remain uncharacterized. Here, we provide an in-depth characterization of microglial proteomic signatures and phenotypes in a NPC1-deficient ( Npc1 -/- ) murine model and patient blood-derived macrophages. We demonstrate enhanced phagocytic uptake and impaired lipid trafficking in Npc1 -/- microglia that precede neuronal death. Loss of NPC1 compromises microglial developmental functions as revealed by increased synaptic pruning and deficient myelin turnover. Undigested myelin accumulates within multi-vesicular bodies of Npc1 -/- microglia while lysosomal degradation remains preserved. To translate our findings to human disease, we generated novel ex vivo assays using patient macrophages that displayed similar proteomic disease signatures and lipid trafficking defects as murine Npc1 -/- microglia. Thus, peripheral macrophages provide a novel promising clinical tool for monitoring disease progression and therapeutic efficacy in NPC patients. Our study underscores an essential role for NPC1 in immune cells and implies microglial therapeutic potential.