Abstract Androgen receptor (AR) is critical to the initiation, growth and progression of almost all prostate cancers. Once activated, the AR binds to cis -regulatory enhancer elements on DNA that drive gene expression. Yet, there are 10-100x more binding sites than differentially expressed genes. It still remains unclear how individual sites contribute to AR-mediated transcription. While descriptive functional genomic approaches broadly correlate with enhancer activity, they do not provide the locus-specific resolution needed to delineate the underlying regulatory logic of AR-mediated transcription. Therefore, we functionally tested all commonly occuring clinical AR binding sites with Self-Transcribing Active Regulatory Regions sequencing (STARRseq) to generate the first map of intrinsic AR enhancer activity. This approach is not significantly affected by endogenous chromatin modifications and measures the potential enhancer activity at each cis -regulatory element. Interestingly we found that only 7% of AR binding sites displayed increased enhancer activity upon hormonal stimulation. Instead, the vast majority of AR binding sites were either inactive (81%) or constitutively active enhancers (11%). These annotations strongly correlated with enhancer-associated features in both cell line and clinical prostate cancer. With these validated annotations we next investigated the effect of each enhancer class on transcription and found that AR-driven inducible enhancers frequently interacted with promoters, forming central chromosomal loops critical for gene transcription. We demonstrated that these inducible enhancers act as regulatory hubs that increase contacts with both other AR binding sites and gene promoters. This functional map was used to identify a somatic mutation that significantly reduces the expression of a commonly mutated AR-regulated tumour suppressor. Together, our data reveal a complex interplay between different AR binding sites that work in a highly coordinated manner to drive gene transcription.

Abstract One of the primary regulatory processes in cells is transcription, during which RNA polymerase II (Pol-II) transcribes DNA into RNA. The binding of Pol-II to its site is regulated through interactions with transcription factors (TFs) that bind to DNA at enhancer cis-regulatory elements. Measuring the enhancer activity of large libraries of distinct DNA sequences is now possible using Massively Parallel Reporter Assays (MPRAs), and computational methods have been developed to identify the dominant statistical patterns of TF binding within these large datasets. Such methods are global in their approach and may overlook important regulatory sites which function only within the local context. Here we introduce a method for inferring functional regulatory sites (their number, location and width) within an enhancer sequence based on measurements of its transcriptional activity from an MPRA method such as STARR-seq. The model is based on a mean-field thermodynamic description of Pol-II binding that includes interactions with bound TFs. Our method applied to simulated STARR-seq data for a variety of enhancer architectures shows how data quality impacts the inference and also how it can find local regulatory sites that may be missed in a global approach. We also apply the method to recently measured STARR-seq data on androgen receptor (AR) bound sequences, a TF that plays an important role in the regulation of prostate cancer. The method identifies key regulatory sites within these sequences which are found to overlap with binding sites of known co-regulators of AR. 1 Author Summary We present an inference method for identifying regulatory sites within a putative DNA enhancer sequence, given only the measured transcriptional output of a set of overlapping sequences using an assay like STARR-seq. It is based on a mean-field thermodynamic model that calculates the binding probability of Pol-II to its promoter and includes interactions with sites in the DNA sequence of interest. By maximizing the likelihood of the data given the model, we can infer the number of regulatory sites, their locations, and their widths. Since it is a local model, it can in principle find regulatory sites that are important within a local context that may get missed in a global fit. We test our method on simulated data of simple enhancer architectures and show that it is able to find only the functional sites. We also apply our method to experimental STARR-seq data from 36 androgen receptor bound DNA sequences from a prostate cancer cell line. The inferred regulatory sites overlap known important regulatory motifs and their ChIP-seq data in these regions. Our method shows potential at identifying locally important functional regulatory sites within an enhancer given only its measured transcriptional output.