The Wilms' tumor gene WT1 is overexpressed in leukemias and various types of solid tumors, and the WT1 protein was demonstrated to be an attractive target antigen for immunotherapy against these malignancies. Here, we report the outcome of a phase I clinical study of WT1 peptide-based immunotherapy for patients with breast or lung cancer, myelodysplastic syndrome, or acute myeloid leukemia. Patients were intradermally injected with an HLA-A*2402-restricted, natural, or modified 9-mer WT1 peptide emulsified with Montanide ISA51 adjuvant at 0.3, 1.0, or 3.0 mg per body at 2-week intervals, with toxicity and clinical and immunological responses as the principal endpoints. Twenty-six patients received one or more WT1 vaccinations, and 18 of the 26 patients completed WT1 vaccination protocol with three or more injections of WT1 peptides. Toxicity consisted only of local erythema at the WT1 vaccine injection sites in patients with breast or lung cancer or acute myeloid leukemia with adequate normal hematopoiesis, whereas severe leukocytopenia occurred in patients with myelodysplastic syndrome with abnormal hematopoiesis derived from WT1-expressing, transformed hematopoietic stem cells. Twelve of the 20 patients for whom the efficacy of WT1 vaccination could be assessed showed clinical responses such as reduction in leukemic blast cells or tumor sizes and/or tumor markers. A clear correlation was observed between an increase in the frequencies of WT1-specific cytotoxic T lymphocytes after WT1 vaccination and clinical responses. It was therefore demonstrated that WT1 vaccination could induce WT1-specific cytotoxic T lymphocytes and result in cancer regression without damage to normal tissues.

Abstract To clarify whether the expression of the WT1 gene in leukemic cells is aberrant or merely reflects that in normal counterparts, the expression levels of the WT1 gene were quantitated for normal hematopoietic progenitor cells. Bone marrow (BM) and umbilical cord blood (CB) cells were fluorescence-activated cell sorting (FACS)-sorted into CD34+ and CD34− cell populations, and the CD34+ cells into nine subsets (CD34+CD33−, CD34+CD33+, CD34+CD38−, CD34+CD38+, CD34+HLA-DR−, CD34+HLA-DR+, CD34+c-kithigh, CD34+c-kitlow, and CD34+c-kit−) according to the expression levels of CD34, CD33, CD38, HLA-DR, and c-kit. Moreover, acute myeloid leukemic cells were also FACS-sorted into four populations (CD34+CD33−, CD34+CD33+, CD34− CD33+, and CD34− CD33−). FACS-sorted normal hematopoietic progenitor and leukemic cells and FACS-unsorted leukemic cells were examined for the WT1 expression by quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction. The WT1 expression in the CD34+ and CD34− cell populations and in the nine CD34+ subsets of BM and CB was at either very low (1.0 to 2.4 × 10−2) or undetectable (<10−2) levels (the WT1 expression level of K562 cells was defined as 1.0), whereas the average levels of WT1 expression in FACS-sorted and -unsorted leukemic cells were 2.4 to 9.3 × 10−1. Thus, the WT1 expression levels in normal hematopoietic progenitor cells were at least 10 times less than those in leukemic cells. Therefore, we could not find any normal counterparts of BM or CB that expressed the WT1 at levels comparable with those in leukemic cells. These results indicate an aberrant overexpression of the WT1 gene in leukemic cells and imply the involvement of this gene in human leukemogenesis.

Active immunization using tumor antigen-loaded dendritic cells holds promise for the adjuvant treatment of cancer to eradicate or control residual disease, but so far, most dendritic cell trials have been performed in end-stage cancer patients with high tumor loads. Here, in a phase I/II trial, we investigated the effect of autologous dendritic cell vaccination in 10 patients with acute myeloid leukemia (AML). The Wilms’ tumor 1 protein (WT1), a nearly universal tumor antigen, was chosen as an immunotherapeutic target because of its established role in leukemogenesis and superior immunogenic characteristics. Two patients in partial remission after chemotherapy were brought into complete remission after intradermal administration of full-length WT1 mRNA-electroporated dendritic cells. In these two patients and three other patients who were in complete remission, the AML-associated tumor marker returned to normal after dendritic cell vaccination, compatible with the induction of molecular remission. Clinical responses were correlated with vaccine-associated increases in WT1-specific CD8 + T cell frequencies, as detected by peptide/HLA-A*0201 tetramer staining, and elevated levels of activated natural killer cells postvaccination. Furthermore, vaccinated patients showed increased levels of WT1-specific IFN-γ–producing CD8 + T cells and features of general immune activation. These data support the further development of vaccination with WT1 mRNA-loaded dendritic cells as a postremission treatment to prevent full relapse in AML patients.

Abstract Memory T cells play an essential role in infectious and tumor immunity. Vitamin A metabolites such as retinoic acid are immune modulators, but the role of vitamin A metabolism in memory T- cell differentiation is unclear. In this study, we identified retinol dehydrogenase 10 (Rdh10), which metabolizes vitamin A to retinal (RAL), as a key molecule for regulating T cell differentiation. T cell-specific Rdh10 deficiency enhanced memory T-cell formation through blocking RAL production in infection model. Epigenetic profiling revealed that retinoic acid receptor (RAR) signaling activated by vitamin A metabolites induced comprehensive epigenetic repression of memory T cell-associated genes, including TCF7, thereby promoting effector T-cell differentiation. Importantly, memory T cells generated by Rdh10 deficiency and blocking RAR signaling elicited potent anti-tumor responses in adoptive T-cell transfer setting. Thus, T cell differentiation is regulated by vitamin A metabolism and its signaling, which should be novel targets for memory T cell-based cancer immunotherapy.

Abstract Animals properly perform sexual behaviors by using multiple sensory cues. However, neural mechanisms integrating multiple sensory cues and regulating motivation for sexual behaviors remain unclear. Here, we focused on peptidergic neurons, terminal nerve gonadotropin-releasing hormone (TN-GnRH) neurons, which receive inputs from various sensory systems and co-express neuropeptide FF (NPFF) in addition to GnRH. Our behavioral analyses using knockout medaka of GnRH ( gnrh3 ) and/or NPFF ( npff ) demonstrated that some sexual behavioral repertories were ‘delayed’, not disrupted, in gnrh3 -/- and npff -/ - males, while the double knockout showed normal behaviors. We also found anatomical evidence to show that both neuropeptides modulate the sexual behavior-controlling brain areas. Furthermore, we demonstrated that NPFF activates neurons in the preoptic area via indirect pathway, which is considered to induce the increase in the motivation for male sexual behaviors. Considering these results, we propose a novel mechanism by which balanced release of co-existing peptides is important for the neuromodulatory function of TN-GnRH neurons in the control of behavioral motivation. Our results may go a long way toward understanding the functional significance of peptidergic neuromodulation in response to external environments.

Abstract Expression patterns of paralogous genes in the functionally homologous cells sometimes show differences across species. However, no reasonable explanation for the mechanism underlying such phenomena has been discovered. To understand this mechanism, the present study focused on the hypophysiotropic GnRH neurons in vertebrates as a model. These neurons express either gnrh1 or gnrh3 paralogs depending on species, and apparent switching of the expressed paralogs in them occurred at least four times in vertebrate evolution. First, we found redundant expressions of gnrh1 and gnrh3 in a single neuron in piranha and hypothesized that this situation may indicate an ancestral condition. We tested this hypothesis by examining the activity of piranha gnrh1/gnrh3 enhancers in zebrafish and medaka, in which the two gnrh paralogs are not co-expressed. Here, the gnrh1/gnrh3 enhancer of piranha induced reporter RFP/GFP co-expressions in a single hypophysiotropic GnRH neuron in both zebrafish and medaka. From these results, we propose that long-lasting (∼550 My) redundancy after gnrh1/3 duplication in 1R/2R WGD may be the key to apparent switching of the paralog usage among the present-day species. Moreover, interspecies analyses of enhancers indicated that the loss of enhancers rather than changes in trans-regulatory elements drove the role-division of these paralogs.

Abstract Successful reproduction requires coordinated regulation of gonadal function and sexual behavior. However, the mechanisms of such a regulation remain elusive. Here, we used a teleost medaka to find out possible involvement of ovulation in the control of female sexual behaviors by analyzing the sexual behaviors of the female gene-knockout medaka that do not ovulate and found that ovulation is essential for the facilitation of female sexual receptivity. Behavioral recordings and anatomical examinations showed that the sexual behavior of medaka occurs only after the ovulation. Furthermore, progesterone administration partially reinstated the sexual receptivity of the anovulatory knockout females. Taken together with the result that progesterone receptor is expressed in the brain regions that are considered strong candidate for regulation of sexual behavior, we propose that female sexual receptivity is facilitated in synchrony with the ovulatory cycle via progesterone receptor signaling in specific brain regions that occurs around the timing of ovulation.

Abstract Feeding and reproduction are known to be closely correlated with each other, and the seasonal breeders show breeding season-dependent feeding behavior. However, most model animals do not have definite breeding seasonality, and the mechanisms for such feeding behavior remain unclear. Here, we focused on female medaka ( Oryzias latipes ); they show breeding season-dependent feeding behavior, and their condition of breeding season can be experimentally controlled by day-length. We first demonstrated that, among previously reported feeding-related peptides (neuropeptides involved in feeding), agouti-related peptide 1 ( agrp1 ) and neuropeptide y b ( npyb ) show higher brain expression under the breeding condition than under the non-breeding one. Combined with analysis of agrp1 knockout medaka, we obtained results to suggest that long day-induced sexually mature condition, especially ovarian estrogenic signals, increase the expressions of agrp1 in the brain, which results in increased food intake to promote reproduction. Our findings advance the understanding of neural mechanisms of feeding behavior for reproductive success.