Abstract The aryl hydroxylase enzyme system is inducible in hamster fetus cell cultures. The enzyme system is localized in the 105,000 x g pellet (microsomal fraction), has an absolute requirement for NADPH and molecular O2, a pH optimum of pH 7.5, and a partial requirement for divalent cations. Exposure to carbon monoxide reduces the enzyme activity. Treatment with ethylenediaminetetraacetate or trypsin completely prevents enzymatic activity. The Km for the hydroxylase is approximately 0.6 µm with benzo[a]pyrene as substrate. Benz[a]anthracene, 7,12-dimethylbenz[a]anthracene, 3-methylcholanthrene, dibenz[a,h]anthracene, and dibenz[a,c]anthracene are also substrates for the enzyme system. The spectrophotofluorometric determination of hydroxylated benzo[a]pyrene products is sufficiently sensitive to detect 10-12 mole per ml and, hence, has great utility in measuring the hydroxylase activity of cells grown in culture. This mammalian cell culture system is advantageous for the study of the mechanism of microsomal enzyme induction and the related areas of carcinogenesis and drug and steroid metabolism.

ADVERTISEMENT RETURN TO ISSUEPREVArticleNEXTHydroxylation of warfarin by human cDNA-expressed cytochrome P-450: a role for P-4502C9 in the etiology of (S)-warfarin-drug interactionsAllan E. Rettie, Kenneth R. Korzekwa, Kent L. Kunze, Ross F. Lawrence, A Craig Eddy, Toshifumi Aoyama, Harry V. Gelboin, Frank J. Gonzalez, and William F. TragerCite this: Chem. Res. Toxicol. 1992, 5, 1, 54–59Publication Date (Print):January 1, 1992Publication History Published online1 May 2002Published inissue 1 January 1992https://pubs.acs.org/doi/10.1021/tx00025a009https://doi.org/10.1021/tx00025a009research-articleACS PublicationsRequest reuse permissionsArticle Views940Altmetric-Citations452LEARN ABOUT THESE METRICSArticle Views are the COUNTER-compliant sum of full text article downloads since November 2008 (both PDF and HTML) across all institutions and individuals. These metrics are regularly updated to reflect usage leading up to the last few days.Citations are the number of other articles citing this article, calculated by Crossref and updated daily. Find more information about Crossref citation counts.The Altmetric Attention Score is a quantitative measure of the attention that a research article has received online. Clicking on the donut icon will load a page at altmetric.com with additional details about the score and the social media presence for the given article. Find more information on the Altmetric Attention Score and how the score is calculated. Share Add toView InAdd Full Text with ReferenceAdd Description ExportRISCitationCitation and abstractCitation and referencesMore Options Share onFacebookTwitterWechatLinked InRedditEmail Other access optionsGet e-Alertsclose Get e-Alerts

Immunoblotting analysis of human liver microsome preparations revealed that human cytochrome P-450 PCN1 (hPCN1, Mr ∼52,000) was expressed in each of 40 individual specimens examined. In about 10–20% of the livers, an immunologically related protein having a lower electrophoretic mobility (Mr ∼52,500) was also detected. A single liver was found that expressed only the lower mobility protein, designated hPCN3, and RNA isolated from this liver was used to construct a λgt11 library. The library was screened with an hPCN1 cDNA probe resulting in the isolation of a unique full-length cDNA that was sequenced and shown to encode hPCN3. The deduced amino acid sequence of this cDNA contained 502 residues, a calculated molecular mass of 57,115 daltons, and displayed 84% similarity with hPCN1. The deduced amino-terminal sequence of hPCN3 was identical to that of HFLa, a major cytochrome P-450 expressed in human fetal liver that is immunologically cross-reactive with several family III cytochrome P-450s. hPCN1 and hPCN3 cDNAs were expressed in Hep G2 cells using a vaccinia virus expression system and shown to encode active enzymes, both characterized by reduced CO-binding spectra with λmax at 450 nm. Enzymatic analysis revealed that both cytochrome P-450s were similarly active in catalyzing oxidation of the calcium channel blocking drug nifedipine. Both enzymes also catalyzed 6β-hydroxylation of the steroid hormones testosterone, progesterone, and androstenedione, although hPCN1 exhibited several-fold higher expressed activity than hPCN3. Several minor oxidation products of these steroids (e.g. 15β-hydroxy testosterone), comprising up to ∼20% of the total metabolites, were formed by hPCN1 but not hPCN3, indicating that hPCN3 is a more highly regiospecific monooxygenase catalyst with steroid substrates. Clear differences were also detected in their catalytic activities toward the immunosuppressive drug cyclosporine, with two hydroxylated metabolites (Ml and M17) and one demethylated metabolite (M21) formed by hPCN1 but only one metabolite (M1) formed by hPCN3. These studies establish that hPCN3 is a newly described cytochrome P-450 that is differentially expressed in the adult human population and that has overlapping substratespecificity compared to hPCN1 for metabolism of steroid and drug substrates.

The cDNAs encoding ethanol-inducible forms of rat and human cytochrome P-450s have been isolated, sequenced, and used to study the expression of this cytochrome P-450 during development and by various inducing agents.Polyclonal antibody against ethanolinducible cytochrome P-450 was used to screen rat and human Xgtl 1 cDNA expression libraries.The longest cDNAs obtained from each library were completely sequenced, and the deduced amino acid sequence of the rat cDNA was found to correspond to P450j based on the published amino-terminal sequence.The rat and human cytochrome P-450s both contained 493 amino acids and calculated molecular masses of 56,634 and 56,916 daltons, respectively.Human P450j shared 75% nucleotide and 78% amino acid similarities to the respective orthologous rat cDNA and deduced amino acid sequences.Amino acid alignment also revealed that P450j was 48% similar to P450b and P450e, the major phenobarbital-inducible forms, and 54% similar to P450PBl and P450f, two developmentally regulated forms.Southern blot analyses of rat and human genomic DNAs verified that only a single gene shared extensive homology with P450j.The expression of P450j was found to be developmentally regulated, No immunodetectable protein or P450j mRNA was present in newborn rats; however, rapid increases in P450j mRNA and protein occurred within 1 week after birth in both male and female rats.The levels of P450j and its mRNA thereafter remained elevated up to 12 weeks of age in both sexes.The increases in both P450j and its mRNA paralleled the change in aniline hydroxylase activity during development.Run-on transcriptional analysis confirmed that these increases were due to transcriptional activation of the P450j gene.In contrast to transcriptional activation during development, induction of P450j by various agents such as pyrazole, 4-methylpyrazole, and acetone might be due to posttranscriptional events.A 4-fold elevation in both enzymatic activity and immunodetectable P450j was not accompanied by an increase in P450j mRNA level.Cytochrome P-450s are the primary enzymes associated with metabolism of foreign compounds, including drugs and