The activation-induced cytidine deaminase (AID) gene, specifically expressed in germinal center B cells in mice, is a member of the cytidine deaminase family. We herein report mutations in the human counterpart of AID in patients with the autosomal recessive form of hyper-IgM syndrome (HIGM2). Three major abnormalities characterize AID deficiency: (1) the absence of immunoglobulin class switch recombination, (2) the lack of immunoglobulin somatic hypermutations, and (3) lymph node hyperplasia caused by the presence of giant germinal centers. The phenotype observed in HIGM2 patients (and in AID−/− mice) demonstrates the absolute requirement for AID in several crucial steps of B cell terminal differentiation necessary for efficient antibody responses.

We have identified a novel gene referred to asactivation-induced deaminase (AID) by subtraction of cDNAs derived from switch-induced and uninduced murine B lymphoma CH12F3-2 cells, more than 80% of which switch exclusively to IgA upon stimulation. The amino acid sequence encoded by AID cDNA is homologous to that of apolipoprotein B (apoB) mRNA-editing enzyme, catalytic polypeptide 1 (APOBEC-1), a type of cytidine deaminase that constitutes a catalytic subunit for the apoB mRNA-editing complex. In vitro experiments using a glutathione S-transferase AID fusion protein revealed significant cytidine deaminase activity that is blocked by tetrahydrouridine and by zinc chelation. However, AID alone did neither demonstrate activity in C to U editing of apoB mRNA nor bind to AU-rich RNA targets. AID mRNA expression is induced in splenic B cells that were activated in vitro or by immunizations with sheep red blood cells. In situ hybridization of immunized spleen sections revealed the restricted expression of AID mRNA in developing germinal centers in which modulation of immunoglobulin gene information through somatic hypermutation and class switch recombination takes place. Taken together, these findings suggest that AID is a new member of the RNA-editing deaminase family and may play a role in genetic events in the germinal center B cell. We have identified a novel gene referred to asactivation-induced deaminase (AID) by subtraction of cDNAs derived from switch-induced and uninduced murine B lymphoma CH12F3-2 cells, more than 80% of which switch exclusively to IgA upon stimulation. The amino acid sequence encoded by AID cDNA is homologous to that of apolipoprotein B (apoB) mRNA-editing enzyme, catalytic polypeptide 1 (APOBEC-1), a type of cytidine deaminase that constitutes a catalytic subunit for the apoB mRNA-editing complex. In vitro experiments using a glutathione S-transferase AID fusion protein revealed significant cytidine deaminase activity that is blocked by tetrahydrouridine and by zinc chelation. However, AID alone did neither demonstrate activity in C to U editing of apoB mRNA nor bind to AU-rich RNA targets. AID mRNA expression is induced in splenic B cells that were activated in vitro or by immunizations with sheep red blood cells. In situ hybridization of immunized spleen sections revealed the restricted expression of AID mRNA in developing germinal centers in which modulation of immunoglobulin gene information through somatic hypermutation and class switch recombination takes place. Taken together, these findings suggest that AID is a new member of the RNA-editing deaminase family and may play a role in genetic events in the germinal center B cell. The germinal center (GC) 1The abbreviations used are: GC, germinal center; CSR, class switch recombination; apoB, apolipoprotein B; APOBEC-1, apoB mRNAediting enzyme, catalytic polypeptide 1; CD40L, CD40 ligand; GST, glutathione S-transferase; THU, tetrahydrouridine; LPS, lipopolysaccharide; RBC, red blood cells; SRBC, sheep RBC; GAPDH, glyceraldehydehyde-3-phosphate dehydrogenase; CHX, cycloheximide; IL, interleukin; TGF, transforming growth factor; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction; kb, kilobase(s).1The abbreviations used are: GC, germinal center; CSR, class switch recombination; apoB, apolipoprotein B; APOBEC-1, apoB mRNAediting enzyme, catalytic polypeptide 1; CD40L, CD40 ligand; GST, glutathione S-transferase; THU, tetrahydrouridine; LPS, lipopolysaccharide; RBC, red blood cells; SRBC, sheep RBC; GAPDH, glyceraldehydehyde-3-phosphate dehydrogenase; CHX, cycloheximide; IL, interleukin; TGF, transforming growth factor; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction; kb, kilobase(s). constitutes a highly specialized microenvironment required for the final maturation step of naive B cells toward antigen-specific memory cells or long-lived plasma cells (1Smith K.G. Light A. Nossal G.J. Tarlinton D.M. EMBO. J. 1997; 16: 2996-3006Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar, 2George J. Claflin L. Semin. Immunol. 1992; 4: 11-17PubMed Google Scholar). Two prominent alterations of immunoglobulin gene information are known to occur in this microenvironment (3Jacob J. Kassir R. Kelsoe G. J. Exp. Med. 1991; 173: 1165-1175Crossref PubMed Scopus (591) Google Scholar, 4Kraal G. Weissman I.L. Butcher E.C. Adv. Exp. Med. Biol. 1985; 186: 145-151PubMed Google Scholar, 5Berek C. Berger A. Apel M. Cell. 1991; 67: 1121-1129Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (748) Google Scholar). First, accumulation of massive point mutations in the variable region exon, a process refer to as somatic hypermutation (6Neuberger M.S. Milstein C. Curr. Opin. Immunol. 1995; 7: 248-254Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar), gives rise to affinity maturation of antibody in association with selection of B cells expressing high affinity immunoglobulins on their surface (7Sablitzky F. Wildner G. Rajewsky K. EMBO J. 1985; 4: 345-350Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar, 8Kocks C. Rajewsky K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988; 85: 8206-8210Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar). Second, class switch recombination (CSR) replaces the exons encoding the heavy chain constant region (9Lorenz M. Radbruch A. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996; 217: 151-169PubMed Google Scholar), which determines effector functions of the antibody including complement fixation. These two alterations of immunoglobulin gene information are critical for accounting for an effective humoral response to harmful microbes. The molecular mechanisms for these genetic events remain to be elucidated despite intensive study.To dissect the molecular mechanism of class switching, we have isolated a murine B lymphoma clone CH12F3-2 in which CSR from IgM to IgA begins to occur within a few hours after stimulation with IL-4, TGF-β, and CD40L, giving rise to more than 80% IgA+ cells (10Kinoshita K. Tashiro J. Tomita S. Lee Chung-Gi Honjo T. Immunity. 1998; 9: 349-358Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (67) Google Scholar, 11Lee C.G. Kondo S. Honjo T. Curr. Biol. 1998; 8: 227-230Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 12Nakamura M. Kondo S. Sugai M. Nazarea M. Imamura S. Honjo T. Int. Immunol. 1996; 8: 193-201Crossref PubMed Scopus (159) Google Scholar). Using CH12F3-2 cells, we have shown that CRS breakpoints are distributed not only within typical repetitive sequences (designated S region) but also in its flanking regions (11Lee C.G. Kondo S. Honjo T. Curr. Biol. 1998; 8: 227-230Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). However, the break points were rarely found in the I and C exons, which are separated by the S region, i.e. the intron of germ-line transcripts. Because accumulating evidence indicates that transcription from I to C exon and splicing of the transcripts are essential to CSR (13Hein K. Lorenz M. Siebenkotten B. Petry K. Christine R. Radbruch A. J. Exp. Med. 1998; 188: 2369-2374Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar, 14Lorenz M. Jung S. Radbruch A. Science. 1995; 267: 1825-1828Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar), it is possible that the transcripts are involved directly or indirectly in CSR. We have thus proposed that a complex structure of DNA and RNA, but not S region sequence per se, is recognized for initiation of CSR (11Lee C.G. Kondo S. Honjo T. Curr. Biol. 1998; 8: 227-230Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). This idea gained further support with the finding that CSR can take place efficiently even when the Sα region was replaced by the Sε or Sγ1 region in minichromosomal constructs introduced in CH12F3-2 cells upon cytokine stimulation (10Kinoshita K. Tashiro J. Tomita S. Lee Chung-Gi Honjo T. Immunity. 1998; 9: 349-358Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (67) Google Scholar).Another type of genetic regulation, RNA-editing, is widely used as a means to create new functional genes from the restricted genome in plants and protozoa (15Scott J. Cell. 1995; 81: 833-836Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (101) Google Scholar, 16Simpson L. Thiemann O.H. Cell. 1995; 81: 837-840Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (71) Google Scholar). An increasing number of mammalian mRNAs are also known to be edited, including apolipoprotein B (apoB) mRNA, glutamate receptor mRNA, Wilms tumor-1 mRNA, α-galactosidase mRNA, neurofibromatosis type-1 mRNA, and tRNAAsp (17Smith H.C. Sowden M.P. Trends Genet. 1996; 12: 418-424Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar). Although most of their molecular mechanisms are yet to be elucidated, that of apoB mRNA editing by APOBEC-1(18, 19) is extensively documented. ApoB mRNA editing involves a site-specific C to U deamination of the first base of a CAA codon, encoding glutamine at residue 2153 in apoB100, and produces a UAA in-frame stop codon in apoB48 mRNA (20Navaratnam N. Bhattacharya S. Fujino T. Patel D. Jarmuz A.L. Scott J. Cell. 1995; 81: 187-195Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (157) Google Scholar). ApoB100 and apoB48 are translation products of the unedited and edited apoB mRNAs, respectively, and these proteins have completely different physiological functions (21Innerarity T.L. Boren J. Yamanaka S. Olofsson S.O. J. Biol. Chem. 1996; 271: 2353-2356Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (123) Google Scholar). APOBEC-1 requires an auxiliary factor(s) for site-specific RNA editing of apoB mRNA (18Teng B. Burant C.F. Davidson N.O. Science. 1993; 260: 1816-1819Crossref PubMed Scopus (491) Google Scholar, 19Navaratnam N. Morrison J.R. Bhattacharya S. Patel D. Funahashi T. Giannoni F. Teng B.B. Davidson N.O. Scott J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 20709-20712Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). APOBEC-1 itself demonstrates cytidine deaminase activity on a monomeric nucleoside substrate and nonspecific, low affinity binding to AU-rich RNA (19Navaratnam N. Morrison J.R. Bhattacharya S. Patel D. Funahashi T. Giannoni F. Teng B.B. Davidson N.O. Scott J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 20709-20712Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 20Navaratnam N. Bhattacharya S. Fujino T. Patel D. Jarmuz A.L. Scott J. Cell. 1995; 81: 187-195Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (157) Google Scholar, 22MacGinnitie A.J. Anant S. Davidson N.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14768-14775Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (110) Google Scholar, 23Anant S. MacGinnitie A.J. Davidson N.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14762-14767Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (103) Google Scholar). Expression and activity of the auxiliary factors are found not only in organs that carry out apoB mRNA editing but also in those that have no detectable levels of APOBEC-1 or apoB mRNA (18Teng B. Burant C.F. Davidson N.O. Science. 1993; 260: 1816-1819Crossref PubMed Scopus (491) Google Scholar, 19Navaratnam N. Morrison J.R. Bhattacharya S. Patel D. Funahashi T. Giannoni F. Teng B.B. Davidson N.O. Scott J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 20709-20712Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 24Yamanaka S. Poksay K.S. Balestra M.E. Zeng G.Q. Innerarity T.L. J. Biol. Chem. 1994; 269: 21725-21734Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Such widespread expression of the auxiliary factors in the absence of APOBEC-1 implies that the auxiliary factors may be involved in either more general cellular functions or editing of other unknown RNAs. However, little is currently known concerning the identity or activity profile of these other components.In this paper we report isolation of cDNA encoding a novelactivation-induced cytidinedeaminase (AID) that is structurally related to the apoB RNA-editing enzyme, APOBEC-1. The restricted expression and inducibility of AID within B cells in GC suggests that AID may play a role in genetic events in GC.DISCUSSIONTo dissect the molecular mechanism of CSR, we screened subtracted cDNA libraries from nonstimulated and stimulated CH12F3-2 cells on the assumption that induction of trans-acting factors, such as switch recombinase, are required for CSR. In support of this, it was demonstrated that cycloheximide treatment inhibited the formation of looped-out circular DNA in stimulated CH12F3-2 cells (Fig. 1,A and B), indicating the requirement for de novo protein synthesis for CSR to take place.Among four novel genes thus isolated, we have characterized AID, which is specifically induced in GC B cells upon immunization. AID contains the active site for cytidine deaminase and catalyzes deamination of cytidine in vitro (Fig. 3). The inhibitory effect of THU and of zinc chelation on enzyme activity suggests that the deamination process may be similar to that of other cytosine deaminases, including APOBEC-1(19). Phylogenetic analysis revealed that AID is located closer to the RNA-editing deaminase rather than other cytosine deaminases (Fig. 2 B), despite the fact that AID lacks RNA editing activity on an apoB RNA template. Mutagenesis studies indicate that Phe-66, Phe-87, His-61, Glu-63, and Cys-93 in mouse APOBEC-1 are essential for RNA binding (17Smith H.C. Sowden M.P. Trends Genet. 1996; 12: 418-424Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar, 20Navaratnam N. Bhattacharya S. Fujino T. Patel D. Jarmuz A.L. Scott J. Cell. 1995; 81: 187-195Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (157) Google Scholar, 22MacGinnitie A.J. Anant S. Davidson N.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14768-14775Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (110) Google Scholar, 23Anant S. MacGinnitie A.J. Davidson N.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14762-14767Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (103) Google Scholar). These residues were noted to be conserved in the AID primary structure (Fig. 2 A). However, as noted above, AID was not found to exhibit apoB RNA binding activity. X-ray crystallographic studies on the E. colicytidine deaminase has revealed its three-dimensional structure, which has similarities with the predicted structure of APOBEC-1(34). The cytosine deaminase family can be divided into two groups in the view of the quaternary organization (35Navaratnam N. Fujino T. Bayliss J. Jarmuz A. How A. Richardson N. Somasekaram A. Bhattacharya S. Carter C. Scott J. J. Mol. Biol. 1998; 275: 695-714Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar). E. coli cytidine deaminase and APOBEC-1 have a pseudoactive site domain in the C terminus, which is required to form a homodimer, whereas the other group,e.g. CMP deaminase, lacks such domain and forms homotetramers. AID contains a leucine-rich C terminus, which is shorter than but similar to the pseudoactive site domain of APOBEC-1 (Fig.2 A), indicating that AID belongs to the APOBEC-1/E. coli cytidine deaminase group. The predicted structural similarity of AID to APOBEC-1 implies that AID may be a novel RNA-editing deaminase induced in GC B cells, although it remains to be determined whether AID assembles into either a homodimer or associates into a heteromeric with the auxiliary factors used by APOBEC-1. Further resolution of this issue will require formal identification of the auxiliary factors themselves.AID mRNA was induced in CH12F3-2 cells within 3 h after cytokine stimulation (Fig. 5). The appearance of AID mRNAs and the onset of CSR in CH12F3 cells thus coincide temporally. AID mRNA expression was induced in splenic B cells after in vitrotreatment with LPS and cytokine, which activates naive B cells to initiate CSR (Fig. 6). AID mRNAs were also up-regulated in splenic B cell in vivo when mice were immunized with the T cell-dependent antigen, SRBC. Furthermore, ex vivo experiments (Fig. 7) and in situ hybridization (Fig. 8) studies revealed that AID mRNA was specifically detected in GC B cells, which are competent to perform somatic hypermutation and CSR. In addition, none of the cell lines examined that do not support CSR, including LyD9, BA/F3, 70Z/3, WEHI231, X63, WEHI-3, EL-4, 2B4, F2, P815, L929, NIH3T3, and ST2, were found to express AID mRNA (data not shown). Taken together, these data indicate that AID mRNA is a GC B cell-specific gene induced upon antigen stimulation. Highly restricted expression of the AID gene in GC B cells together with the concordant onset of AID induction and CSR suggest its role in GC function. Furthermore, the possibility of RNA-editing activity on other templates inspires us to speculate that AID may participate in regulatory steps unique to GC function such as somatic hypermutation and CSR. It is of note that the efficiency of CSR in CH12F3-2 cells is increased up to double when cells were stimulated in the presence of THU (data not shown). The physiological function of AID is currently being investigated by gene targeting and transgenic techniques. The germinal center (GC) 1The abbreviations used are: GC, germinal center; CSR, class switch recombination; apoB, apolipoprotein B; APOBEC-1, apoB mRNAediting enzyme, catalytic polypeptide 1; CD40L, CD40 ligand; GST, glutathione S-transferase; THU, tetrahydrouridine; LPS, lipopolysaccharide; RBC, red blood cells; SRBC, sheep RBC; GAPDH, glyceraldehydehyde-3-phosphate dehydrogenase; CHX, cycloheximide; IL, interleukin; TGF, transforming growth factor; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction; kb, kilobase(s).1The abbreviations used are: GC, germinal center; CSR, class switch recombination; apoB, apolipoprotein B; APOBEC-1, apoB mRNAediting enzyme, catalytic polypeptide 1; CD40L, CD40 ligand; GST, glutathione S-transferase; THU, tetrahydrouridine; LPS, lipopolysaccharide; RBC, red blood cells; SRBC, sheep RBC; GAPDH, glyceraldehydehyde-3-phosphate dehydrogenase; CHX, cycloheximide; IL, interleukin; TGF, transforming growth factor; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction; kb, kilobase(s). constitutes a highly specialized microenvironment required for the final maturation step of naive B cells toward antigen-specific memory cells or long-lived plasma cells (1Smith K.G. Light A. Nossal G.J. Tarlinton D.M. EMBO. J. 1997; 16: 2996-3006Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar, 2George J. Claflin L. Semin. Immunol. 1992; 4: 11-17PubMed Google Scholar). Two prominent alterations of immunoglobulin gene information are known to occur in this microenvironment (3Jacob J. Kassir R. Kelsoe G. J. Exp. Med. 1991; 173: 1165-1175Crossref PubMed Scopus (591) Google Scholar, 4Kraal G. Weissman I.L. Butcher E.C. Adv. Exp. Med. Biol. 1985; 186: 145-151PubMed Google Scholar, 5Berek C. Berger A. Apel M. Cell. 1991; 67: 1121-1129Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (748) Google Scholar). First, accumulation of massive point mutations in the variable region exon, a process refer to as somatic hypermutation (6Neuberger M.S. Milstein C. Curr. Opin. Immunol. 1995; 7: 248-254Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar), gives rise to affinity maturation of antibody in association with selection of B cells expressing high affinity immunoglobulins on their surface (7Sablitzky F. Wildner G. Rajewsky K. EMBO J. 1985; 4: 345-350Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar, 8Kocks C. Rajewsky K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988; 85: 8206-8210Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar). Second, class switch recombination (CSR) replaces the exons encoding the heavy chain constant region (9Lorenz M. Radbruch A. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996; 217: 151-169PubMed Google Scholar), which determines effector functions of the antibody including complement fixation. These two alterations of immunoglobulin gene information are critical for accounting for an effective humoral response to harmful microbes. The molecular mechanisms for these genetic events remain to be elucidated despite intensive study. To dissect the molecular mechanism of class switching, we have isolated a murine B lymphoma clone CH12F3-2 in which CSR from IgM to IgA begins to occur within a few hours after stimulation with IL-4, TGF-β, and CD40L, giving rise to more than 80% IgA+ cells (10Kinoshita K. Tashiro J. Tomita S. Lee Chung-Gi Honjo T. Immunity. 1998; 9: 349-358Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (67) Google Scholar, 11Lee C.G. Kondo S. Honjo T. Curr. Biol. 1998; 8: 227-230Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 12Nakamura M. Kondo S. Sugai M. Nazarea M. Imamura S. Honjo T. Int. Immunol. 1996; 8: 193-201Crossref PubMed Scopus (159) Google Scholar). Using CH12F3-2 cells, we have shown that CRS breakpoints are distributed not only within typical repetitive sequences (designated S region) but also in its flanking regions (11Lee C.G. Kondo S. Honjo T. Curr. Biol. 1998; 8: 227-230Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). However, the break points were rarely found in the I and C exons, which are separated by the S region, i.e. the intron of germ-line transcripts. Because accumulating evidence indicates that transcription from I to C exon and splicing of the transcripts are essential to CSR (13Hein K. Lorenz M. Siebenkotten B. Petry K. Christine R. Radbruch A. J. Exp. Med. 1998; 188: 2369-2374Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar, 14Lorenz M. Jung S. Radbruch A. Science. 1995; 267: 1825-1828Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar), it is possible that the transcripts are involved directly or indirectly in CSR. We have thus proposed that a complex structure of DNA and RNA, but not S region sequence per se, is recognized for initiation of CSR (11Lee C.G. Kondo S. Honjo T. Curr. Biol. 1998; 8: 227-230Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). This idea gained further support with the finding that CSR can take place efficiently even when the Sα region was replaced by the Sε or Sγ1 region in minichromosomal constructs introduced in CH12F3-2 cells upon cytokine stimulation (10Kinoshita K. Tashiro J. Tomita S. Lee Chung-Gi Honjo T. Immunity. 1998; 9: 349-358Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (67) Google Scholar). Another type of genetic regulation, RNA-editing, is widely used as a means to create new functional genes from the restricted genome in plants and protozoa (15Scott J. Cell. 1995; 81: 833-836Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (101) Google Scholar, 16Simpson L. Thiemann O.H. Cell. 1995; 81: 837-840Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (71) Google Scholar). An increasing number of mammalian mRNAs are also known to be edited, including apolipoprotein B (apoB) mRNA, glutamate receptor mRNA, Wilms tumor-1 mRNA, α-galactosidase mRNA, neurofibromatosis type-1 mRNA, and tRNAAsp (17Smith H.C. Sowden M.P. Trends Genet. 1996; 12: 418-424Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar). Although most of their molecular mechanisms are yet to be elucidated, that of apoB mRNA editing by APOBEC-1(18, 19) is extensively documented. ApoB mRNA editing involves a site-specific C to U deamination of the first base of a CAA codon, encoding glutamine at residue 2153 in apoB100, and produces a UAA in-frame stop codon in apoB48 mRNA (20Navaratnam N. Bhattacharya S. Fujino T. Patel D. Jarmuz A.L. Scott J. Cell. 1995; 81: 187-195Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (157) Google Scholar). ApoB100 and apoB48 are translation products of the unedited and edited apoB mRNAs, respectively, and these proteins have completely different physiological functions (21Innerarity T.L. Boren J. Yamanaka S. Olofsson S.O. J. Biol. Chem. 1996; 271: 2353-2356Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (123) Google Scholar). APOBEC-1 requires an auxiliary factor(s) for site-specific RNA editing of apoB mRNA (18Teng B. Burant C.F. Davidson N.O. Science. 1993; 260: 1816-1819Crossref PubMed Scopus (491) Google Scholar, 19Navaratnam N. Morrison J.R. Bhattacharya S. Patel D. Funahashi T. Giannoni F. Teng B.B. Davidson N.O. Scott J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 20709-20712Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). APOBEC-1 itself demonstrates cytidine deaminase activity on a monomeric nucleoside substrate and nonspecific, low affinity binding to AU-rich RNA (19Navaratnam N. Morrison J.R. Bhattacharya S. Patel D. Funahashi T. Giannoni F. Teng B.B. Davidson N.O. Scott J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 20709-20712Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 20Navaratnam N. Bhattacharya S. Fujino T. Patel D. Jarmuz A.L. Scott J. Cell. 1995; 81: 187-195Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (157) Google Scholar, 22MacGinnitie A.J. Anant S. Davidson N.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14768-14775Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (110) Google Scholar, 23Anant S. MacGinnitie A.J. Davidson N.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14762-14767Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (103) Google Scholar). Expression and activity of the auxiliary factors are found not only in organs that carry out apoB mRNA editing but also in those that have no detectable levels of APOBEC-1 or apoB mRNA (18Teng B. Burant C.F. Davidson N.O. Science. 1993; 260: 1816-1819Crossref PubMed Scopus (491) Google Scholar, 19Navaratnam N. Morrison J.R. Bhattacharya S. Patel D. Funahashi T. Giannoni F. Teng B.B. Davidson N.O. Scott J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 20709-20712Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 24Yamanaka S. Poksay K.S. Balestra M.E. Zeng G.Q. Innerarity T.L. J. Biol. Chem. 1994; 269: 21725-21734Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Such widespread expression of the auxiliary factors in the absence of APOBEC-1 implies that the auxiliary factors may be involved in either more general cellular functions or editing of other unknown RNAs. However, little is currently known concerning the identity or activity profile of these other components. In this paper we report isolation of cDNA encoding a novelactivation-induced cytidinedeaminase (AID) that is structurally related to the apoB RNA-editing enzyme, APOBEC-1. The restricted expression and inducibility of AID within B cells in GC suggests that AID may play a role in genetic events in GC. DISCUSSIONTo dissect the molecular mechanism of CSR, we screened subtracted cDNA libraries from nonstimulated and stimulated CH12F3-2 cells on the assumption that induction of trans-acting factors, such as switch recombinase, are required for CSR. In support of this, it was demonstrated that cycloheximide treatment inhibited the formation of looped-out circular DNA in stimulated CH12F3-2 cells (Fig. 1,A and B), indicating the requirement for de novo protein synthesis for CSR to take place.Among four novel genes thus isolated, we have characterized AID, which is specifically induced in GC B cells upon immunization. AID contains the active site for cytidine deaminase and catalyzes deamination of cytidine in vitro (Fig. 3). The inhibitory effect of THU and of zinc chelation on enzyme activity suggests that the deamination process may be similar to that of other cytosine deaminases, including APOBEC-1(19). Phylogenetic analysis revealed that AID is located closer to the RNA-editing deaminase rather than other cytosine deaminases (Fig. 2 B), despite the fact that AID lacks RNA editing activity on an apoB RNA template. Mutagenesis studies indicate that Phe-66, Phe-87, His-61, Glu-63, and Cys-93 in mouse APOBEC-1 are essential for RNA binding (17Smith H.C. Sowden M.P. Trends Genet. 1996; 12: 418-424Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar, 20Navaratnam N. Bhattacharya S. Fujino T. Patel D. Jarmuz A.L. Scott J. Cell. 1995; 81: 187-195Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (157) Google Scholar, 22MacGinnitie A.J. Anant S. Davidson N.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14768-14775Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (110) Google Scholar, 23Anant S. MacGinnitie A.J. Davidson N.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14762-14767Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (103) Google Scholar). These residues were noted to be conserved in the AID primary structure (Fig. 2 A). However, as noted above, AID was not found to exhibit apoB RNA binding activity. X-ray crystallographic studies on the E. colicytidine deaminase has revealed its three-dimensional structure, which has similarities with the predicted structure of APOBEC-1(34). The cytosine deaminase family can be divided into two groups in the view of the quaternary organization (35Navaratnam N. Fujino T. Bayliss J. Jarmuz A. How A. Richardson N. Somasekaram A. Bhattacharya S. Carter C. Scott J. J. Mol. Biol. 1998; 275: 695-714Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar). E. coli cytidine deaminase and APOBEC-1 have a pseudoactive site domain in the C terminus, which is required to form a homodimer, whereas the other group,e.g. CMP deaminase, lacks such domain and forms homotetramers. AID contains a leucine-rich C terminus, which is shorter than but similar to the pseudoactive site domain of APOBEC-1 (Fig.2 A), indicating that AID belongs to the APOBEC-1/E. coli cytidine deaminase group. The predicted structural similarity of AID to APOBEC-1 implies that AID may be a novel RNA-editing deaminase induced in GC B cells, although it remains to be determined whether AID assembles into either a homodimer or associates into a heteromeric with the auxiliary factors used by APOBEC-1. Further resolution of this issue will require formal identification of the auxiliary factors themselves.AID mRNA was induced in CH12F3-2 cells within 3 h after cytokine stimulation (Fig. 5). The appearance of AID mRNAs and the onset of CSR in CH12F3 cells thus coincide temporally. AID mRNA expression was induced in splenic B cells after in vitrotreatment with LPS and cytokine, which activates naive B cells to initiate CSR (Fig. 6). AID mRNAs were also up-regulated in splenic B cell in vivo when mice were immunized with the T cell-dependent antigen, SRBC. Furthermore, ex vivo experiments (Fig. 7) and in situ hybridization (Fig. 8) studies revealed that AID mRNA was specifically detected in GC B cells, which are competent to perform somatic hypermutation and CSR. In addition, none of the cell lines examined that do not support CSR, including LyD9, BA/F3, 70Z/3, WEHI231, X63, WEHI-3, EL-4, 2B4, F2, P815, L929, NIH3T3, and ST2, were found to express AID mRNA (data not shown). Taken together, these data indicate that AID mRNA is a GC B cell-specific gene induced upon antigen stimulation. Highly restricted expression of the AID gene in GC B cells together with the concordant onset of AID induction and CSR suggest its role in GC function. Furthermore, the possibility of RNA-editing activity on other templates inspires us to speculate that AID may participate in regulatory steps unique to GC function such as somatic hypermutation and CSR. It is of note that the efficiency of CSR in CH12F3-2 cells is increased up to double when cells were stimulated in the presence of THU (data not shown). The physiological function of AID is currently being investigated by gene targeting and transgenic techniques. To dissect the molecular mechanism of CSR, we screened subtracted cDNA libraries from nonstimulated and stimulated CH12F3-2 cells on the assumption that induction of trans-acting factors, such as switch recombinase, are required for CSR. In support of this, it was demonstrated that cycloheximide treatment inhibited the formation of looped-out circular DNA in stimulated CH12F3-2 cells (Fig. 1,A and B), indicating the requirement for de novo protein synthesis for CSR to take place. Among four novel genes thus isolated, we have characterized AID, which is specifically induced in GC B cells upon immunization. AID contains the active site for cytidine deaminase and catalyzes deamination of cytidine in vitro (Fig. 3). The inhibitory effect of THU and of zinc chelation on enzyme activity suggests that the deamination process may be similar to that of other cytosine deaminases, including APOBEC-1(19). Phylogenetic analysis revealed that AID is located closer to the RNA-editing deaminase rather than other cytosine deaminases (Fig. 2 B), despite the fact that AID lacks RNA editing activity on an apoB RNA template. Mutagenesis studies indicate that Phe-66, Phe-87, His-61, Glu-63, and Cys-93 in mouse APOBEC-1 are essential for RNA binding (17Smith H.C. Sowden M.P. Trends Genet. 1996; 12: 418-424Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar, 20Navaratnam N. Bhattacharya S. Fujino T. Patel D. Jarmuz A.L. Scott J. Cell. 1995; 81: 187-195Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (157) Google Scholar, 22MacGinnitie A.J. Anant S. Davidson N.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14768-14775Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (110) Google Scholar, 23Anant S. MacGinnitie A.J. Davidson N.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14762-14767Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (103) Google Scholar). These residues were noted to be conserved in the AID primary structure (Fig. 2 A). However, as noted above, AID was not found to exhibit apoB RNA binding activity. X-ray crystallographic studies on the E. colicytidine deaminase has revealed its three-dimensional structure, which has similarities with the predicted structure of APOBEC-1(34). The cytosine deaminase family can be divided into two groups in the view of the quaternary organization (35Navaratnam N. Fujino T. Bayliss J. Jarmuz A. How A. Richardson N. Somasekaram A. Bhattacharya S. Carter C. Scott J. J. Mol. Biol. 1998; 275: 695-714Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar). E. coli cytidine deaminase and APOBEC-1 have a pseudoactive site domain in the C terminus, which is required to form a homodimer, whereas the other group,e.g. CMP deaminase, lacks such domain and forms homotetramers. AID contains a leucine-rich C terminus, which is shorter than but similar to the pseudoactive site domain of APOBEC-1 (Fig.2 A), indicating that AID belongs to the APOBEC-1/E. coli cytidine deaminase group. The predicted structural similarity of AID to APOBEC-1 implies that AID may be a novel RNA-editing deaminase induced in GC B cells, although it remains to be determined whether AID assembles into either a homodimer or associates into a heteromeric with the auxiliary factors used by APOBEC-1. Further resolution of this issue will require formal identification of the auxiliary factors themselves. AID mRNA was induced in CH12F3-2 cells within 3 h after cytokine stimulation (Fig. 5). The appearance of AID mRNAs and the onset of CSR in CH12F3 cells thus coincide temporally. AID mRNA expression was induced in splenic B cells after in vitrotreatment with LPS and cytokine, which activates naive B cells to initiate CSR (Fig. 6). AID mRNAs were also up-regulated in splenic B cell in vivo when mice were immunized with the T cell-dependent antigen, SRBC. Furthermore, ex vivo experiments (Fig. 7) and in situ hybridization (Fig. 8) studies revealed that AID mRNA was specifically detected in GC B cells, which are competent to perform somatic hypermutation and CSR. In addition, none of the cell lines examined that do not support CSR, including LyD9, BA/F3, 70Z/3, WEHI231, X63, WEHI-3, EL-4, 2B4, F2, P815, L929, NIH3T3, and ST2, were found to express AID mRNA (data not shown). Taken together, these data indicate that AID mRNA is a GC B cell-specific gene induced upon antigen stimulation. Highly restricted expression of the AID gene in GC B cells together with the concordant onset of AID induction and CSR suggest its role in GC function. Furthermore, the possibility of RNA-editing activity on other templates inspires us to speculate that AID may participate in regulatory steps unique to GC function such as somatic hypermutation and CSR. It is of note that the efficiency of CSR in CH12F3-2 cells is increased up to double when cells were stimulated in the presence of THU (data not shown). The physiological function of AID is currently being investigated by gene targeting and transgenic techniques. We thank Drs. H. Ikuta S. Minoguchi, and K. Kuroda for discussion and suggestions. We also thank M. Yamamoto and T. Tabuchi for their technical assistance and Y. Takahashi and T. Tanaka for secretarial help.

Background & Aims: Most gastrointestinal stromal tumors (GISTs) have gain-of-function mutations of c-kit receptor tyrosine kinase (KIT) gene, but some GISTs do not. We investigated the cause of GISTs without KIT mutations. Because GISTs apparently expressed platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) α, we examined whether GISTs without KIT mutations had a mutation of PDGFR α. Methods: Whole coding region of PDGFR α complementary DNA (cDNA) was sequenced in GISTs with or without KIT mutations. Mutant PDGFR α cDNA was transfected into 293T human embryonic kidney cells, and autophosphorylation of PDGFR α was examined. Proliferation of Ba/F3 murine lymphoid cells stably transfected with mutant PDGFR α cDNA was estimated by tritium thymidine incorporation. Wild-type KIT cDNA was cotransfected with mutant PDGFR α cDNA, and immunoprecipitation by anti-KIT antibody was performed. Inhibitory effect of Imatinib mesylate on activated PDGFR α was examined. Results: We found 2 types of constitutively activated mutations of PDGFR α, Val-561 to Asp or Asp-842 to Val, in 5 of 8 GISTs without KIT mutations but not in 10 GISTs with KIT mutations. Stable transfection of each mutation induced autonomous proliferation of Ba/F3 cells. Constitutively activated mutant PDGFR α bound and activated the cotransfected wild-type KIT. The constitutive activation of PDGFR α with Val-561 to Asp was inhibited effectively by Imatinib mesylate but that of PDGFR α with Asp-842 to Val was inhibited only weakly, even at the concentration of 10 μmol/L. Conclusions: The gain-of-function mutations of PDGFR α appear to play an important role in development of GISTs without KIT mutations.

Infection with Helicobacter pylori (H. pylori) is a risk factor for the development of gastric cancer. Here we show that infection of gastric epithelial cells with 'cag' pathogenicity island (cagPAI)-positive H. pylori induced aberrant expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a member of the cytidine-deaminase family that acts as a DNA- and RNA-editing enzyme, via the IκB kinase–dependent nuclear factor-κB activation pathway. H. pylori–mediated upregulation of AID resulted in the accumulation of nucleotide alterations in the TP53 tumor suppressor gene in gastric cells in vitro. Our findings provide evidence that aberrant AID expression caused by H. pylori infection might be a mechanism of mutation accumulation in the gastric mucosa during H. pylori–associated gastric carcinogenesis.

Genome stability is regulated by the balance between efficiencies of the repair machinery and genetic alterations such as mutations and chromosomal rearrangements. It has been postulated that deregulation of class switch recombination (CSR) and somatic hypermutation (SHM), which modify the immunoglobulin (Ig) genes in activated B cells, may be responsible for aberrant chromosomal translocations and mutations of non-Ig genes that lead to lymphocyte malignancy. However, the molecular basis for these genetic instabilities is not clearly understood. Activation-induced cytidine deaminase (AID) is shown to be essential and sufficient to induce both CSR and SHM in artificial substrates in fibroblasts as well as B cells. Here we show that constitutive and ubiquitous expression of AID in transgenic mice caused both T cell lymphomas and dysgenetic lesions of epithelium of respiratory bronchioles (micro-adenomas) in all individual mice. Point mutations, but not translocations, were massively introduced in expressed T cell receptor (TCR) and c-myc genes in T lymphoma cells. The results indicate that AID can mutate non-Ig genes including oncogenes, implying that aberrant AID expression could be a cause of human malignancy.

Immunoglobulin A (IgA) is generated in the gut by both T cell-dependent and T cell-independent processes. The sites and the mechanisms for T cell-independent IgA synthesis remain elusive. Here we show that isolated lymphoid follicles (ILFs) were sites where induction of activation-induced cytidine deaminase (AID) and IgA class switching of B cells took place in the absence of T cells. We also show that formation of ILFs was regulated by interactions between lymphoid tissue-inducer cells expressing the nuclear receptor RORγt (RORγt+LTi cells) and stromal cells (SCs). Activation of SCs by RORγt+LTi cells through lymphotoxin (LT)-β receptor (LTβR) and simultaneously by bacteria through TLRs induced recruitment of dendritic cells (DCs) and B cells and formation of ILFs. These findings provide insight into the crosstalk between bacteria, RORγt+LTi cells, SCs, DCs, and B cells required for ILF formation and establish a critical role of ILFs in T cell-independent IgA synthesis in gut.