The tumour suppressor complex BRCA1–BARD1 functions in the repair of DNA double-stranded breaks by homologous recombination. During this process, BRCA1–BARD1 facilitates the nucleolytic resection of DNA ends to generate a single-stranded template for the recruitment of another tumour suppressor complex, BRCA2–PALB2, and the recombinase RAD51. Here, by examining purified wild-type and mutant BRCA1–BARD1, we show that both BRCA1 and BARD1 bind DNA and interact with RAD51, and that BRCA1–BARD1 enhances the recombinase activity of RAD51. Mechanistically, BRCA1–BARD1 promotes the assembly of the synaptic complex, an essential intermediate in RAD51-mediated DNA joint formation. We provide evidence that BRCA1 and BARD1 are indispensable for RAD51 stimulation. Notably, BRCA1–BARD1 mutants with weakened RAD51 interactions show compromised DNA joint formation and impaired mediation of homologous recombination and DNA repair in cells. Our results identify a late role of BRCA1–BARD1 in homologous recombination, an attribute of the tumour suppressor complex that could be targeted in cancer therapy. The tumour suppressor complex BRCA1–BARD1, which facilitates the generation of a single-stranded DNA template during homologous recombination, also binds to the recombinase RAD51 and enhances its function. Two of the hereditary breast cancer susceptibility genes (BRCAs) act during the initial stages of recombinational DNA repair. BRCA1, together with BARD1, helps to form the single-stranded DNA that is then bound by another complex, BRCA2–PALB2, which facilitates loading of the central DNA strand exchange factor, RAD51. Patrick Sung and colleagues now show that BRCA1–BARD1 can also directly interact with RAD51 and stimulate the formation of the synaptic complex—a crucial intermediate that aligns the damaged and repair template DNA molecules. Because cancer cells depend on functioning DNA repair to thrive, targeting these factors may provide therapeutic value.

Article23 September 2019Open Access Source DataTransparent process Chromatin-bound cGAS is an inhibitor of DNA repair and hence accelerates genome destabilization and cell death Hui Jiang Hui Jiang orcid.org/0000-0003-1170-0224 The Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden (MIMS), Umeå Centre for Microbial Research (UCMR), Umeå University, Umeå, Sweden Search for more papers by this author Xiaoyu Xue Xiaoyu Xue Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA Department of Chemistry and Biochemistry, Texas State University, San Marcos, TX, USA Search for more papers by this author Swarupa Panda Swarupa Panda orcid.org/0000-0001-7622-5116 The Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden (MIMS), Umeå Centre for Microbial Research (UCMR), Umeå University, Umeå, Sweden Search for more papers by this author Ajinkya Kawale Ajinkya Kawale Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA Search for more papers by this author Richard M Hooy Richard M Hooy Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA Search for more papers by this author Fengshan Liang Fengshan Liang Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA Search for more papers by this author Jungsan Sohn Jungsan Sohn Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA Search for more papers by this author Patrick Sung Patrick Sung Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, San Antonio, TX, USA Search for more papers by this author Nelson O Gekara Corresponding Author Nelson O Gekara [email protected] [email protected] orcid.org/0000-0002-1269-8288 The Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden (MIMS), Umeå Centre for Microbial Research (UCMR), Umeå University, Umeå, Sweden Department of Molecular Biosciences, The Wenner-Gren Institute, Stockholm University, Stockholm, Sweden Search for more papers by this author Hui Jiang Hui Jiang orcid.org/0000-0003-1170-0224 The Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden (MIMS), Umeå Centre for Microbial Research (UCMR), Umeå University, Umeå, Sweden Search for more papers by this author Xiaoyu Xue Xiaoyu Xue Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA Department of Chemistry and Biochemistry, Texas State University, San Marcos, TX, USA Search for more papers by this author Swarupa Panda Swarupa Panda orcid.org/0000-0001-7622-5116 The Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden (MIMS), Umeå Centre for Microbial Research (UCMR), Umeå University, Umeå, Sweden Search for more papers by this author Ajinkya Kawale Ajinkya Kawale Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA Search for more papers by this author Richard M Hooy Richard M Hooy Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA Search for more papers by this author Fengshan Liang Fengshan Liang Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA Search for more papers by this author Jungsan Sohn Jungsan Sohn Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA Search for more papers by this author Patrick Sung Patrick Sung Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, San Antonio, TX, USA Search for more papers by this author Nelson O Gekara Corresponding Author Nelson O Gekara [email protected] [email protected] orcid.org/0000-0002-1269-8288 The Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden (MIMS), Umeå Centre for Microbial Research (UCMR), Umeå University, Umeå, Sweden Department of Molecular Biosciences, The Wenner-Gren Institute, Stockholm University, Stockholm, Sweden Search for more papers by this author Author Information Hui Jiang1, Xiaoyu Xue2,3, Swarupa Panda1, Ajinkya Kawale2, Richard M Hooy4, Fengshan Liang2, Jungsan Sohn4, Patrick Sung2,5 and Nelson O Gekara *,*,1,6 1The Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden (MIMS), Umeå Centre for Microbial Research (UCMR), Umeå University, Umeå, Sweden 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA 3Department of Chemistry and Biochemistry, Texas State University, San Marcos, TX, USA 4Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA 5Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, San Antonio, TX, USA 6Department of Molecular Biosciences, The Wenner-Gren Institute, Stockholm University, Stockholm, Sweden *Corresponding author. Tel: +46 729430478; E-mails: [email protected]; [email protected] The EMBO Journal (2019)38:e102718https://doi.org/10.15252/embj.2019102718 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract DNA repair via homologous recombination (HR) is indispensable for genome integrity and cell survival but if unrestrained can result in undesired chromosomal rearrangements. The regulatory mechanisms of HR are not fully understood. Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is best known as a cytosolic innate immune sensor critical for the outcome of infections, inflammatory diseases, and cancer. Here, we report that cGAS is primarily a chromatin-bound protein that inhibits DNA repair by HR, thereby accelerating genome destabilization, micronucleus generation, and cell death under conditions of genomic stress. This function is independent of the canonical STING-dependent innate immune activation and is physiologically relevant for irradiation-induced depletion of bone marrow cells in mice. Mechanistically, we demonstrate that inhibition of HR repair by cGAS is linked to its ability to self-oligomerize, causing compaction of bound template dsDNA into a higher-ordered state less amenable to strand invasion by RAD51-coated ssDNA filaments. This previously unknown role of cGAS has implications for understanding its involvement in genome instability-associated disorders including cancer. Synopsis cGMP-AMP synthase (cGAS) is best known as a cytosolic DNA sensor activating STING-dependent innate immune signaling pathways. Chromatin-bound cGAS is here shown to have an independent function in impeding homologous recombination (HR) repair of nuclear DNA and facilitating genome destabilization. cGAS is constitutively present in the nucleus as a chromatin-bound protein in various cell types. Chromatin-bound cGAS restrains DNA repair and accelerates genome destabilization, generation of micronuclei, and cell death independently of STING signaling. cGAS deficiency protects against γ-irradiation-induced ablation of bone marrow cells in vivo. Nuclear cGAS restrains DNA repair by HR, although not being specifically recruited to double-strand breaks. cGAS impedes HR repair by oligomerizing on and compacting bound dsDNA it into a higher-order state less amenable to invasion by RAD51-filaments. Introduction Both the innate immune system—the inherent ability to rapidly sense and respond to infections—and the DNA damage response (DDR), which reacts to threats to our genome, function as surveillance systems essential for preserving the integrity of organisms. Emerging evidence indicates that these two systems are interdependent (Hartlova et al, 2015) and that defects in these two systems lie at the heart of many diseases such as infections, autoimmunity, cancer, and aging-associated disorders including neurodegeneration (Hartlova et al, 2015; Erttmann et al, 2016). The molecular factors involved in the cross-talk between the DDR and the innate immune system, as well as the underlying mechanisms, remain poorly defined. The cyclic GMP-AMP synthase cGAS is well known as innate immune sensor that surveys the cytosol for the presence of microbial DNA (Gao et al, 2013b; Sun et al, 2013), as well as self-DNA released from the nucleus under conditions of genomic stress (Hartlova et al, 2015) or from stressed mitochondria (West et al, 2015). Upon recognition of double-stranded DNA (dsDNA), cGAS catalyzes the cyclization of ATP and GTP into the second messenger cyclic GMP–AMP (2′3′-cGAMP) (Ablasser et al, 2013; Civril et al, 2013; Diner et al, 2013; Gao et al, 2013a,2013b; Li et al, 2013; Sun et al, 2013; Zhang et al, 2013). Subsequently, cGAMP binds to its adaptor STING (Stimulator of Interferon Genes) (Ishikawa & Barber, 2008), leading to the activation of downstream innate immune responses. Dysfunctions in the cGAS-STING pathway have been implicated in many disorders including infections, inflammatory diseases, neurodegeneration, and cancer (Barber, 2015; Chen et al, 2016). cGAS is generally considered as a cytosolic protein but transiently accumulates in the nucleus following mitotic nuclear membrane dissolution (Yang et al, 2017; Gentili et al, 2019; Zierhut et al, 2019). Moreover, cGAS has also been reported to actively translocate from the cytosol into the nucleus upon DNA damage (Liu et al, 2018) but also localizes to the plasma membrane in some cell types (Barnett et al, 2019). In spite of these reports, the subcellular localization and function of cGAS in different biological conditions remain hotly debated (Gekara & Jiang, 2019). Double-strand DNA breaks (DSB) are potentially highly deleterious lesions. If improperly repaired, DSB results in chromosomal deletions or translocations culminating in genome instability-associated disorders including tumorigenesis, accelerated aging, and other diseases (Jackson & Bartek, 2009). DSB repair occurs via two major pathways: non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) (Chapman et al, 2012; Ceccaldi et al, 2016). NHEJ is an error-prone repair pathway active throughout the cell cycle, and it entails the ligation of DNA ends and often leads to deletion or insertional mutations (Chapman et al, 2012; Ceccaldi et al, 2016). On the other hand, HR is an accurate repair process active in proliferating cells and occurs mainly during the S and G2 cell cycle phases wherein it engages the undamaged sister chromatid to template break repair to restore the original DNA sequence (Chapman et al, 2012; Ceccaldi et al, 2016). For a healthy outcome, activation of these pathways is carefully calibrated to ensure timely removal of damaged DNA breaks, but, if the DNA damage is excessive, to promote the induction of cell death to eradicate genetically altered cells (Vitale et al, 2011). The regulatory molecules involved in this delicate balance are not fully known. In this study, we identify a new regulator of DNA repair: cGAS. We demonstrate that cGAS is constantly present in the nucleus as a chromatin-bound protein where it acts as a negative regulator of homologous recombination-mediated DNA repair, thereby accelerating micronucleus generation and death of cells under genomic stress. We show that this non-canonical cGAS function is independent of the STING axis. Results cGAS is constitutively present in the nucleus While monitoring the subcellular localization of endogenous cGAS in bone morrow-differentiating monocytes (BMDMos) (Fig 1A–I) or exogenously expressed GFP-tagged human cGAS (GFP-hcGAS) in HEK293 cells (Fig EV1A–C), we noticed that cGAS is primarily in the nucleus. Because transient accumulation of cGAS in the nucleus following mitotic nuclear membrane dissolution has previously been observed (Yang et al, 2017; Gentili et al, 2019), we asked whether nuclear localization of cGAS was sensitive to changes in cell cycle. For that, we enriched cells at G0/G1 cell cycle phase by culturing them at high cell density to induce cell contact inhibition (Figs 1A, D and G, and EV1A), or in serum-free medium (Figs 1B, E and H, and EV1B), or arrested them at G1/early S phase using the DNA polymerase α inhibitor aphidicolin (Figs 1C, F and I, and EV1C). Although showing a slightly increased presence in the cytosol in cells arrested at G0/G1 or G1/early S boundary, cGAS was still abundant in the nucleus (Figs 1 and EV1). This demonstrates that cGAS is constitutively present in the nucleus and cytosol and that the relative abundance of cGAS in these subcellular compartments can to some extent be affected by the cell cycle. To verify the nuclear localization of cGAS, we examined additional cell types including the human THP1 monocytes and the HeLa cells, mouse Raw 264.7 macrophages, and bone marrow-derived macrophages (BMDMs). We found cGAS to be abundant in both the nucleus and cytosol of these different cell types (Fig EV1D). Figure 1. cGAS is constantly present in the cytosol and nucleus and is impacted by cell cycle A–C. Left: Immunofluorescence images of cGAS in the nucleus (DAPI) and cytosol (phalloidin) in BMDMos cultured at low/high density (A), with/without serum (B), or with/without aphidicolin (Aphi) (C). Scale bar: 50 μm. Right: Corresponding quantification of the nuclear cGAS from 6 different fields with n > 50 cells. D–F. Immunoblot estimation of cGAS in nuclear/cytosolic subcellular fraction of BMDMos cultured under indicated conditions. Lamin B and α-tubulin are nuclear and cytosolic markers, respectively. G–I. Flow cytometric analysis of cell cycle of BMDMos depicted in (D–F). Data information: Data are presented as means ± SEM. Statistical significance was assessed using unpaired Student's t-test. ****P ≤ 0.0001. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 1 [embj2019102718-sup-0003-SDataFig1.pdf] Download figure Download PowerPoint Click here to expand this figure. Figure EV1. cGAS is constantly present in the cytosol and nucleus Immunoblot estimation of GFP-hcGAS in nuclear/cytosolic fractions and corresponding flow cytometric analysis of cell cycle of HEK293 cells cultured in low or high density. Lamin B and α-tubulin are nuclear and cytosolic markers, respectively. Immunoblot estimation of GFP-hcGAS in nuclear/cytosolic fractions and corresponding flow cytometric analysis of cell cycle of HEK293 cells cultured with or without serum. Lamin B and α-tubulin are nuclear and cytosolic markers, respectively. Immunoblot estimation of GFP-hcGAS in nuclear/cytosolic fractions and corresponding flow cytometric analysis of cell cycle of HEK293 cells cultured with or without aphidicolin. Lamin B and α-tubulin are nuclear and cytosolic markers, respectively. cGAS in nuclear/cytosolic fractions of indicated cell types. Source data are available online for this figure. Download figure Download PowerPoint To elucidate the cGAS features essential for its nuclear localization, we analyzed different cGAS mutants. The nuclear localization of the catalytically dead E225A/D227A mutant (GFP-hcGASΔcGAMP) (Raab et al, 2016) and the oligomerization-defective K394E mutant (GFP-hcGASΔOligo) (Li et al, 2013) was comparable to that of the wild-type form GFP-hcGAS. In contrast, the DNA binding C396A/C397A mutant (GFP-hcGASΔDNA) (Ablasser et al, 2013; Kranzusch et al, 2013) showed a decreased nuclear presence and was unaffected by the cell cycle phase (Fig EV2A and B). These findings demonstrate that association of cGAS with genomic DNA is required for its nuclear localization. To interrogate this further, we asked whether introduction of a strong nuclear export or import signal (NES or NLS, respectively) would impact cGAS localization. The NLS localized cGAS almost entirely in the nucleus, whereas the NES substantially increased the cytosolic localization of cGAS but did not eliminate its presence in the nucleus (Fig EV2C and D). Taken together with the behavior of the cGASΔDNA mutant (Fig EV2A), these results confirm that the localization and retention of cGAS in the nucleus is due to its association with genomic DNA and, as such, even a strong NES is insufficient to exclude cGAS from the nucleus. Click here to expand this figure. Figure EV2. Localization and retention of cGAS in the nucleus is due to is avid binding to DNA A. Fluorescence images of GFP-hcGAS, GFP-hcGASΔcGAMP, GFP-hcGASΔDNA, and GFP-hcGASΔOligo in HEK293 cells cultured with or without aphidicolin. Scale bar: 20 μm. B. Corresponding quantification of (A). The nuclear cGAS/total cGAS was calculated from 6 different fields with n > 50 cells. C, D. A nuclear export signaling (NES) is not sufficient to dislodge chromatin-bound cGAS from the nucleus. (C) Fluorescence images of GFP-hcGAS, GFP-hcGAS-NLS, and GFP-hcGAS-NES in HEK293 cells. Scale bar: 10 μm. (D) Immunoblots of subcellular fractions of GFP-hCGAS-, GFP-hCGAS-NLS-, and GFP-hCGAS-NES-expressing HEK293 cells. Data information: Data are presented as means ± SEM. Statistical significance was assessed using one-way ANOVA followed by Sidak's post-test. NS: P > 0.05 and ****P ≤ 0.0001. Source data are available online for this figure. Download figure Download PowerPoint Nuclear cGAS accelerates genome destabilization, micronucleus generation, and cell death We wished to determine the biological role of nuclear cGAS. Micronuclei are a hallmark of genome instability. Micronuclei arise following the mis-segregation of broken chromosomes during mitosis (Crasta et al, 2012; Gekara, 2017; Mackenzie et al, 2017) and have recently been described as platforms for cGAS-mediated innate immune activation following DNA damage (Bartsch et al, 2017; Gekara, 2017; Harding et al, 2017; Mackenzie et al, 2017). We found that in response to γ-irradiation, HEK293 cells expressing GFP-hcGAS exhibit a higher incidence of micronuclei than cells expressing a GFP control containing a nuclear localization sequence (GFP-NLS) (Fig 2A and B). As expected, GFP-hcGAS, but not GFP-NLS, restored IFNB1 response to transfected DNA (Fig 2C). This observation led us to hypothesize that the presence of cGAS in the nucleus and micronucleus generation was causally related. Hence, we tested whether endogenous cGAS promotes micronucleus generation in bone marrow-differentiating monocytes (BMDMos). To induce micronucleus generation, BMDMos were synchronized in G2/M phase using the microtubule-depolymerizing agent nocodazole followed by γ-irradiation then released (Fig 2D). BMDMos from WT mice exhibited more micronuclei compared to those from cGAS−/− mice (Fig 2E and F), demonstrating a role for cGAS in accelerating genomic destabilization and micronucleus generation. Noteworthy, we observed in addition to the nucleus all the micronuclei were cGAS-positive. Based on these data, we conclude that micronucleus-associated cGAS emanates mainly from the nucleus as opposed to an influx from the cytosol post-micronucleus membrane rapture (Harding et al, 2017; Mackenzie et al, 2017). Figure 2. cGAS promotes irradiation-induced micronucleus generation and cell death A, B. Micronuclei (indicated by arrowhead) in GFP-NLS- or GFP-hcGAS-expressing HEK293 cells before (0 h) or 24 h after γ-irradiation (IR; 10 Gy). Scale bar: 10 μm (A). (B) The average MNs/cell. Graphs show mean ± SEM (n = 3 independent experiments) representing six different microscopic fields with over 200 cells. C. IFNB1 response in HEK293 cells stimulated with transfected plasmid DNA. Mean ± SEM of n = 3 independent experiments. D. Experimental outline for micronucleus generation and cell death after γ-irradiation. E. Micronucleus (indicated by arrowhead) and cGAS staining in WT and cGAS−/− BMDMos exposed to γ-irradiation (10 Gy). Scale bar: 10 μm. F. Average MNs/cell in BMDMos. MN graphs show mean ± SEM (n = 3 independent experiments) representing eight different microscopic fields with over 200 cells. G. Cell death in WT and cGAS−/− BMDMos that were first synchronized at G2/M, then γ-irradiated (10 Gy) followed by release and analysis at indicated time points. Mean ± SD, x biological triplicates (n = 3) per treatment group are shown. Data information: Statistical significance in (B), (C), and (F) was assessed using unpaired two-tailed Student's t-test. ***P ≤ 0.001 and ****P ≤ 0.0001. Statistical significance in (G) was assessed using two-way ANOVA test, ****P < 0.0001. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 2 [embj2019102718-sup-0004-SDataFig2.pdf] Download figure Download PowerPoint To further elucidate the biological relevance of nuclear cGAS, we tested the impact of cGAS on DNA damage-induced cell death. BMDMos from cGAS−/− mice were resistant to irradiation-induced cell death compared to those from WT mice (Fig 2G). Thus, by accelerating genomic destabilization, micronucleus generation, and cell death, cGAS likely contributes to the elimination of cells with severely damaged genomes. cGAS impedes DNA repair independently of STING Next, we sought to determine whether cGAS contributes to genomic instability by inhibiting DNA double-strand break (DSB) repair and whether this was via the canonical STING pathway. For that, we monitored the levels of DSBs at different time points following γ-irradiation by comet and pulsed-field gel electrophoresis assays. We found that γ-irradiated BMDMos from cGAS−/− mice are more adept at resolving DSBs than those from WT mice (Figs 3A and B and EV3A). Curiously, while γ-irradiated BMDMos from cGAS−/− mice exhibited faster DSB resolution, those from Sting−/− mice were comparable to WT BMDMos in this regard (Fig 3A and B). Furthermore, expression of GFP-hcGAS in HEK293T cells that lack endogenous cGAS and STING (Sun et al, 2013) impaired DSB repair in these cells (Fig EV3B), but, as expected, failed to restore the IFNB1 response (Fig EV3C). Thus, while essential for the induction of inflammatory genes following DNA damage via STING (Hartlova et al, 2015; Erdal et al, 2017), cGAS also promotes DNA damage by inhibiting DSB repair independently of STING. Figure 3. cGAS inhibits DNA damage repair and promotes micronucleus generation and cell death independently of STING A, B. BMDMos from cGAS−/− mice exhibit enhanced DNA repair efficiency than those from WT and Sting−/− mice. (A) Representative comet tails of WT, cGAS−/−, and Sting−/−BMDMos exposed to γ-irradiation (IR: 10 Gy) on ice, then incubated at 37°C for indicated duration. (B) Corresponding quantification of the comet tail moments from 20 different fields with n > 200 comets of three independent experiments. C, D. cGAS promotes micronucleus generation in BMDMos independently of STING. (C) Confocal microscopic visualization of micronucleus (indicated by arrowhead) and cGAS staining in WT, cGAS−/−, and Sting−/− BMDMos exposed to γ-irradiation (10 Gy). Scale bar: 10 μm. (D) Average MNs/cell in corresponding representative images. Bar graphs show mean values from eight different microscopic fields with over 200 cells. E, F. γ-Irradiation-induced cell death in WT and cGAS−/− BMDMos (E). γ-Irradiation-induced cell death in Sting−/− and cGAS−/− Sting−/− BMDMos (F). Data information: Data are presented as mean ± SEM of n = 3 independent experiments. Statistical significance was assessed using two-way ANOVA in (B) and one-way ANOVA in (D), (E), and (F) followed by Sidak's post-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 3 [embj2019102718-sup-0005-SDataFig3.pdf] Download figure Download PowerPoint Click here to expand this figure. Figure EV3. STING signaling is dispensable for inhibition of DNA repair by cGAS A. Pulsed-field gel electrophoresis analysis of γ-irradiated (10 Gy) WT and cGAS−/− BMDMos. B, C. Comet assay in GFP-NLS- and GFP-hcGAS-expressing HEK293T cells γ-irradiated (IR: 10 Gy) for 15 min (B). RT–PCR analysis of IFNB1 response in GFP-NLS- or GFP-hcGAS-expressing HEK293T cells stimulated with transfected DNA for 6 h (C). D, E. Comet assay of HEK293 cells stimulated with 10 μg/ml cGAMP for indicate periods, then γ-irradiated and incubated at 37°C for indicated duration (D). (E) Immunoblots of IRF3 phosphorylation in HEK293 cells treated as in (D). F–H. Images (F) and quantifications (G) of comet tails 15 min after irradiation of GFP-NLS-, GFP-hcGAS-, and GFP-hcGASΔcGAMP-expressing HEK293 cells. RT–PCR analysis of IFNB1 response in GFP-NLS- or GFP-hcGAS-expressing HEK293 cells stimulated with transfected 23 DNA for 6 h (H). I, J. Images (I) and quantifications (J) of micronuclei in GFP-NLS- and GFP-hcGASΔcGAMP-expressing HEK293 cells 24 h after γ-irradiation (IR; 10 Gy). DAPI (DNA). Scale bar: 10 μm. Each data set bar comet graph was calculated from six different microscopic fields with over 200 cells. K. Quantifications of comet tails 15 min after irradiation (10 Gy) of GFP-NLS-, GFP-hcGAS-, or GFP-mcGAS-expressing HEK293 cells. Each data set bar comet graph was calculated from six different microscopic fields with over 200 cells. Data information: Statistical significance was assessed using one-way ANOVA followed by Sidak's post-test. NS P > 0.05, ***P ≤ 0.001, and ****P ≤ 0.0001. Mean ± SEM of n = 3 independent experiments. Source data are available online for this figure. Download figure Download PowerPoint To further interrogate how cGAS affects genome stability, we considered whether inhibition of DSB repair was mediated by cGAMP via a hitherto undefined STING-independent mechanism. However, treatment of HEK293 cells with cGAMP before or during γ-irradiation did not lead to increased fragmentation of genomic DNA (Fig EV3D), but, as expected, activated STING-dependent interferon regulatory factor (IRF3) (Fig EV3E). Accordingly, the full-length and catalytically dead GFP-hcGASΔcGAMP comparably inhibited DSB repair in HEK293 cells, as assessed by comet tail length (Fig EV3F and G). As expected, unlike GFP-hcGAS, GFP-hcGASΔcGAMP failed to restore the IFN-I response (Fig EV3H) but boosted micronucleus generation (Fig EV3I and J). Further, analysis of WT, cGAS−/−, Sting−/−, and cGAS−/− Sting−/− BMDMos revealed that cGAS-driven micronucleus generation and cell death are independent of STING (Fig 3C–F). Finally, when we compared human cGAS (hcGAS) and mouse cGAS (mcGAS), we found them to inhibit DNA repair comparably when exogenously expressed in HEK293 cells (Fig EV3K). cGAS drives γ-irradiation-induced bone marrow ablation independently of STING To establish the in vivo physiological relevance of cGAS-mediated inhibition of DNA repair, we examined the depletion of bone marrow cells in mice following γ-irradiation. First, by analyzing wild-type mice, we found that following acute γ-irradiation (9 Gy), over 90% of bone marrow cells are depleted within the first 36 h (Fig 4A–D). When WT and cGAS−/− mice were compared 10 h after γ-irradiation, cGAS−/− mice were found to be more resistant to γ-irradiation-induced bone marrow cell depletion (Fig 4E–H). Further, compared to Sting−/− mice, Sting−/− cGAS−/− mice were more resistant to γ-irradiation-induced bone marrow ablation (Fig 4I–L), confirming that cGAS-mediated inhibition of DNA repair and accelerated cell death in vivo is independent of the STING pathway. Figure 4. cGAS accelerates γ-irradiation-induced depletion of bone marrow cells independently of STING A–D. Kinetics of in vivo depletion of indicated bone marrow cells in WT mice (n = 3) after γ-irradiation (9 Gy). E–H. Bone marrow cells in WT (n = 3) and cGAS−/− (n = 3) mice 10 h post-γ-irradiation. I–L. Bone marrow cells in Sting−/− (n = 3) and cGAS−/− Sting−/− (n = 3) mice 10 h post-γ-irradiation. Data information: Data in this figure are presented as mean ± SD. One-way ANOVA followed by Sidak's post-test. NS: P > 0.05, *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, and ****P ≤ 0.0001. Download figure Download PowerPoint cGAS attenuates HR-DNA repair via DNA binding and self-oligomerization DSB repair occurs via two major pathways: non-homologous end-joining (NHEJ) that is active throughout the cell cycle and homologous recombination (HR) that occurs during the S and G2 cell cycle (Chapman et al, 2012; Ceccaldi et al, 2016). To determine which of these repair pathways is impeded by cGAS, firstly we asked whether cGAS impacts cell cycle. Cell cycle analysis revealed that WT and cGAS−/− BMDMos were comparable and that up to 81% of cells were in the HR-competent S/G2 phase (Appendix Fig S1A). Interestingly, arresting cells at the G1/early S phase using aphidicolin abolished the inhibitory effect of cGAS on DSB repair (Appendix Fig S1B and C), indicating that cGAS was likely targeting the HR pathways and that this inhibition was not due to difference in cell cycle. To specifically evaluate the DSB repair pathway impeded by cGAS, we examined the repair of a site-specific DSB induced by the I-SceI endonuclease using the direct repeat-GFP (DR-GFP) (Pierce et al, 2001) and the total-NHEJ-GFP (EJ5-GFP) (Be

Stringent regulation of DNA repair is essential for organismal integrity, but the mechanisms are not fully understood. Cyclic cGMP-AMP synthase (cGAS), the DNA sensor that alerts the innate immune system to the presence of foreign or damaged self-DNA in the cytoplasm is critical for the outcome of infections, inflammatory diseases and cancer. Besides this cytoplasmic function as an innate immune sensor, whether cGAS fulfills other biological roles remains unknown. Here we report that cGAS has a distinct role in the nucleus: it inhibits homologous recombination DNA repair (HR) thereby promoting genome instability and associated micronuclear generation and mitotic death. We show that cGAS-mediated inhibition of HR requires its DNA binding and oligomerization but not its catalytic activity or the downstream innate immune signaling events. Mechanistically, we show that cGAS impede RAD51-mediated DNA strand invasion, a key step in HR. These results uncover a new function of cGAS relevant for understanding its involvement in genome instability- associated disorders.