The smoothened (SMO) receptor, a key signal transducer in the hedgehog signalling pathway, is responsible for the maintenance of normal embryonic development and is implicated in carcinogenesis. It is classified as a class frizzled (class F) G-protein-coupled receptor (GPCR), although the canonical hedgehog signalling pathway involves the GLI transcription factors and the sequence similarity with class A GPCRs is less than 10%. Here we report the crystal structure of the transmembrane domain of the human SMO receptor bound to the small-molecule antagonist LY2940680 at 2.5 Å resolution. Although the SMO receptor shares the seven-transmembrane helical fold, most of the conserved motifs for class A GPCRs are absent, and the structure reveals an unusually complex arrangement of long extracellular loops stabilized by four disulphide bonds. The ligand binds at the extracellular end of the seven-transmembrane-helix bundle and forms extensive contacts with the loops. The crystal structure of the human smoothened (SMO) receptor is presented in complex with a small-molecule antitumour agent; this represents the first example of a non-class-A, 7-transmembrane (7TM) receptor structure, revealing different conserved motifs common within class frizzled 7TM receptors and an unusually complex arrangement of long extracellular loops stabilized by disulphide bonds. The smoothened (SMO) receptor is a key signal transducer in the hedgehog signalling pathway that is responsible for the maintenance of normal embryonic development and is also implicated in carcinogenesis. The SMO receptor was classified as a class frizzled (class F) G-protein-coupled receptor (GPCR). In this paper the authors report the X-ray crystal structure of the human SMO receptor bound to the small-molecule antagonist LY2940680, an orally active anticancer compound that is in clinical trials. This is the first published structure of a non-class-A GPCR; most conserved motifs for class A GPCRs are absent, and the structure reveals an unusually complex arrangement of long extracellular loops stabilized by four disulphide bonds.

Establishment of oligodendrocyte identity is crucial for subsequent events of myelination in the CNS. Here, we demonstrate that activation of ATP-dependent SWI/SNF chromatin-remodeling enzyme Smarca4/Brg1 at the differentiation onset is necessary and sufficient to initiate and promote oligodendrocyte lineage progression and maturation. Genome-wide multistage studies by ChIP-seq reveal that oligodendrocyte-lineage determination factor Olig2 functions as a prepatterning factor to direct Smarca4/Brg1 to oligodendrocyte-specific enhancers. Recruitment of Smarca4/Brg1 to distinct subsets of myelination regulatory genes is developmentally regulated. Functional analyses of Smarca4/Brg1 and Olig2 co-occupancy relative to chromatin epigenetic marking uncover stage-specific cis-regulatory elements that predict sets of transcriptional regulators controlling oligodendrocyte differentiation. Together, our results demonstrate that regulation of the functional specificity and activity of a Smarca4/Brg1-dependent chromatin-remodeling complex by Olig2, coupled with transcriptionally linked chromatin modifications, is critical to precisely initiate and establish the transcriptional program that promotes oligodendrocyte differentiation and subsequent myelination of the CNS.

Transcription factors (TFs) are key regulators for gene expression. Here we updated the animal TF database AnimalTFDB to version 2.0 (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/). Using the improved prediction pipeline, we identified 72 336 TF genes, 21 053 transcription co-factor genes and 6502 chromatin remodeling factor genes from 65 species covering main animal lineages. Besides the abundant annotations (basic information, gene model, protein functional domain, gene ontology, pathway, protein interaction, ortholog and paralog, etc.) in the previous version, we made several new features and functions in the updated version. These new features are: (i) gene expression from RNA-Seq for nine model species, (ii) gene phenotype information, (iii) multiple sequence alignment of TF DNA-binding domains, and the weblogo and phylogenetic tree based on the alignment, (iv) a TF prediction server to identify new TFs from input sequences and (v) a BLAST server to search against TFs in AnimalTFDB. A new nice web interface was designed for AnimalTFDB 2.0 allowing users to browse and search all data in the database. We aim to maintain the AnimalTFDB as a solid resource for TF identification and studies of transcription regulation and comparative genomics.

Abstract A missense mutation of collagen type VIII alpha 2 chain (COL8A2) gene leads to early onset Fuchs’ endothelial corneal dystrophy (FECD), which progressively impairs vision through loss of corneal endothelial cells. We demonstrate that CRISPR/Cas9-based postnatal gene editing achieves structural and functional rescue in a mouse model of FECD. A single intraocular injection of an adenovirus encoding both the Cas9 gene and guide RNA (Ad-Cas9-Col8a2gRNA), efficiently knocked down mutant COL8A2 expression in corneal endothelial cells, prevented endothelial cell loss, and rescued corneal endothelium pumping function in adult Col8a2 mutant mice. There were no adverse sequelae on histology or electroretinography. Col8a2 start codon disruption represents a non-surgical strategy to prevent vision loss in early-onset FECD. As this demonstrates the ability of Ad-Cas9-gRNA to restore phenotype in adult post-mitotic cells, this method may be widely applicable to adult-onset diseases, even in tissues affected with disorders of non-reproducing cells.

Abstract Enhancer is a class of non-coding DNA cis-acting elements that plays a crucial role in the development of eukaryotes for their transcription. Computational methods for predicting enhancers have been developed and achieve satisfactory performance. However, existing computational methods suffer from experience-based feature engineering and lack of interpretability, which not only limit the representation ability of the models to some extent, but also make it difficult to provide interpretable analysis of the model prediction findings.In this paper, we propose a novel deep-learning-based model, iEnhancer-CLA, for identifying enhancers and their strengths. Specifically, iEnhancer-CLA automatically learns sequence 1D features through multiscale convolutional neural networks (CNN), and employs a self-attention mechanism to represent global features formed by multiple elements (multibody effects). In particular, the model can provide an interpretable analysis of the enhancer motifs and key base signals by decoupling CNN modules and generating self-attention weights. To avoid the bias of setting hyperparameters manually, we construct Bayesian optimization methods to obtain model global optimization hyperparameters. The results demonstrate that our method outperforms existing predictors in terms of accuracy for identifying enhancers and their strengths. Importantly, our analyses found that the distribution of bases in enhancers is uneven and the base G contents are more enriched, while the distribution of bases in non-enhancers is relatively even. This result contributes to the improvement of prediction performance and thus facilitates revealing an in-depth understanding of the potential functional mechanisms of enhancers. Author summary The enhancers contain many subspecies and the accuracy of existing models is difficult to improve due to the small data set. Motivated by the need for accurate and efficient methods to predict enhancer types, we developed a self-attention deep learning model iEnhancer-CLA, the aim is to be able to distinguish effectively and quickly between subspecies of enhancers and whether they are enhancers or not. The model is able to learn sequence features effectively through the combination of multi-scale CNN blocks, BLSTM layers, and self-attention mechanisms, thus improving the accuracy of the model. Encouragingly, by decoupling the CNN layer it was found that the layer was effective in learning the motif of the sequences, which in combination with the self-attention weights could provide interpretability to the model. We further performed sequence analysis in conjunction with the model-generated weights and discovered differences in enhancer and non-enhancer sequence characteristics. This phenomenon can be a guide for the construction of subsequent models for identifying enhancer sequences.

RNA binding proteins play myriad roles in controlling and regulating RNAs and RNA-mediated functions, often through simultaneous binding to other cellular factors. In bacteria, the RNA chaperone Hfq modulates post-transcriptional gene regulation. Absence of Hfq leads to the loss of fitness and compromises the virulence of bacterial pathogens. Using live-cell super-resolution imaging, we are able to distinguish Hfq binding to different sizes of cellular RNAs. We demonstrate that under normal growth conditions, Hfq exhibits widespread mRNA binding activity. Particularly, the distal face of Hfq contributes mostly to the mRNA binding in vivo. In addition, binding of Hfq to these mRNAs can recruit RNase E to promote turnover of these mRNAs in an sRNA-independent manner, providing one mechanism to release Hfq from the pre-bound mRNAs. Finally, our data indicate that sRNAs, once expressed, can either co-occupy Hfq with the mRNA or displace the mRNA from Hfq, suggesting mechanisms through which sRNAs rapidly access Hfq to induce sRNA-mediated gene regulation. Our data collectively demonstrate that Hfq dynamically changes its interactions with different RNAs in response to changes in cellular conditions.

Abstract Photoreceptors, especially cones, which are enriched in the human macula, have high energy demands, making them vulnerable to metabolic stress. Metabolic dysfunction of photoreceptors and their supporting retinal pigment epithelium (RPE) is an important underlying cause of degenerative retinal diseases. However, how cones and the macula support their exorbitant metabolic demand and communicate with RPE is unclear. By profiling metabolite uptake and release and analyzing metabolic genes, we have found cone-rich retinas and human macula share specific metabolic features with upregulated pathways in pyruvate metabolism, mitochondrial TCA cycle and lipid synthesis. Human neural retina and RPE have distinct but complementary metabolic features. Retinal metabolism centers on NADH production and neurotransmitter biosynthesis. The retina needs aspartate to sustain its aerobic glycolysis and mitochondrial metabolism. RPE metabolism is directed toward NADPH production and biosynthesis of acetyl-rich metabolites, serine and others. RPE consumes multiple nutrients, including proline, to produce metabolites for the retina.

Summary The telencephalon and eye in mammals are originated from adjacent fields at the anterior neural plate. Morphogenesis of these fields generates telencephalon, optic-stalk, optic-disc, and neuroretina along a spatial axis. How these telencephalic and ocular tissues are specified coordinately to ensure directional retinal ganglion cell (RGC) axon growth is unclear. Here, we report the self-formation of human telencephalon-eye organoids comprising concentric zones of telencephalic, optic-stalk, optic-disc, and neuroretinal tissues along the center-periphery axis. Initially-differentiated RGCs grew axons towards and then along a path defined by adjacent PAX2+ optic-disc cells. Single-cell RNA sequencing of CONCEPT organoids not only confirmed telencephalic and ocular identities but also identified expression signatures of early optic-disc, optic-stalk, and RGCs. These signatures were similar to those in human fetal retinas. Optic-disc cells in CONCEPT organoids differentially expressed FGF8 and FGF9 ; FGFR inhibitions drastically decreased RGC differentiation and directional axon growth. Through the identified RGC-specific cell-surface marker CNTN2, electrophysiologically-excitable RGCs were isolated under a native condition. Our findings provide insight into the coordinated specification of early telencephalic and ocular tissues in humans and establish resources for studying RGC-related diseases such as glaucoma. Impact statement A human telencephalon-eye organoid model that exhibited axon growth and pathfinding from retinal ganglion cell (RGC) axons is reported; via cell surface marker CNTN2 identified using scRNA-seq, early RGCs were isolated under a native condition.

Formation, maintenance, and differentiation of tissue-specific progenitor cells are fundamental tasks during organogenesis. Retinal development is an excellent model for dissecting these processes; mechanisms of retinal differentiation can be harnessed for retinal regeneration toward curing blindness. Using single-cell RNA sequencing of embryonic mouse eye cups in which transcription factor Six3 was conditionally inactivated in peripheral retinas on top of germline deletion of its close paralog Six6 ("DKO"), we identified cell clusters and then inferred developmental trajectories in the integrated dataset. In control retinas, naïve retinal progenitor cells had two major trajectories leading to ciliary margin cells and retinal neurons, respectively. The ciliary margin trajectory was directly from naïve retinal progenitor cells at G1 phase, and the retinal neuron trajectory was through a neurogenic state marked by Atoh7 expression. Upon Six3 and Six6 dual deficiency, both naïve and neurogenic retinal progenitor cells were defective. Ciliary margin differentiation was enhanced, and multi-lineage retinal differentiation was disrupted. An ectopic neuronal trajectory lacking the Atoh7+ state led to ectopic neurons. Differential expression analysis not only confirmed previous phenotype studies but also identified novel candidate genes regulated by Six3/Six6 . Six3 and Six6 were jointly required for balancing the opposing gradients of the Fgf and Wnt signaling in the central-peripheral patterning of the eye cups. Taken together, we identify transcriptomes and developmental trajectories jointly regulated by Six3 and Six6, providing deeper insight into molecular mechanisms underlying early retinal differentiation.