Autophagy is a central homeostasis and stress response pathway conserved in all eukaryotes. One hallmark of autophagy is the de novo formation of autophagosomes. These double-membrane vesicular structures form around and deliver cargo for degradation by the vacuole/lysosome. Where and how autophagosomes form are outstanding questions. Here we show, using proteomic, cytological, and functional analyses, that autophagosomes are spatially, physically, and functionally linked to endoplasmic reticulum exit sites (ERES), which are specialized regions of the endoplasmic reticulum where COPII transport vesicles are generated. Our data demonstrate that ERES are core autophagosomal biogenesis components whose function is required for the hierarchical assembly of the autophagy machinery immediately downstream of the Atg1 kinase complex at phagophore assembly sites.

The environmental bacterium Legionella pneumophila is an intracellular parasite of free-living freshwater protozoa, and an opportunistic human pathogen. The L. pneumophila biphasic lifestyle depends on a complex regulatory network that is responsive to nutrient depletion cues to enable the switch from the vegetative replicative form (RF) to the environmentally resilient transmissive phase (TP) form. For a subset of TP-associated traits, RNA polymerase co-factor DksA cooperates with stringent response alarmone ppGpp to influence gene expression. Here we report that, through a dysfunctional DksA mutation (DksA1), a synergistic interplay was discovered between DksA and transcription regulator PsrA that contributes to virulence in Acanthamoeba castellanii protozoa. DksA could fully rescue an intracellular growth defect of a dksA1 strain and vice versa, whereas PsrA overexpression could partially rescue the growth defect of dksA1 strain. Conversely, in trans DksA expression fully restored the growth defect of a ΔpsrA strain. Different phenotypes were observed in vitro ; either DksA or DksA1 are required for extended culturability of bacterial cells in depleted broth, and altered cell morphology along with lack of pigmentation exhibited by the ΔdksA strain could only be rescued by DksA. Comparative structural modeling predicts that the DksA1 mutation affects coordination of a Mg2+ into the active site of RNAP compromising transcription efficiency. Thus, the largely overlapping and additive phenotypes presented in this study has led us to propose that PsrA assists DksA in the regulation of TP-associated traits. Additionally, in vitro evidence suggests that the long chain fatty chain response, one of the cues leading to stringent response activation, is mediated by PsrA together with DksA inferring a novel regulatory link to the stringent response pathway.