Most cancer cells release heterogeneous populations of extracellular vesicles (EVs) containing proteins, lipids, and nucleic acids. In vitro experiments showed that EV uptake can lead to transfer of functional mRNA and altered cellular behavior. However, similar in vivo experiments remain challenging because cells that take up EVs cannot be discriminated from non-EV-receiving cells. Here, we used the Cre-LoxP system to directly identify tumor cells that take up EVs in vivo. We show that EVs released by malignant tumor cells are taken up by less malignant tumor cells located within the same and within distant tumors and that these EVs carry mRNAs involved in migration and metastasis. By intravital imaging, we show that the less malignant tumor cells that take up EVs display enhanced migratory behavior and metastatic capacity. We postulate that tumor cells locally and systemically share molecules carried by EVs in vivo and that this affects cellular behavior.

This study sought to comprehensively identify predictors of stent thrombosis (ST).Given the devastating consequences of ST, efforts should be directed toward risk stratification to identify patients at highest risk for ST.Consecutive patients with angiographic ST were enrolled. Patients who did not suffer from a ST were randomly selected in a 2:1 ratio and were matched for: 1) percutaneous coronary intervention (PCI) indication; 2) same date of index PCI; and 3) same interventional center.Of 21,009 patients treated with either a bare-metal or drug-eluting stent, 437 patients (2.1%) presented with a definite ST. A total of 140 STs were acute, 180 were subacute, 58 were late, and 59 were very late. Undersizing of the coronary stent, Thrombolysis In Myocardial Infarction flow grade <3, present malignancy, presence of intermediate coronary artery disease proximal and distal to the culprit lesion, dissection, lack of aspirin, bifurcation lesions, ejection fraction <30%, and younger age were associated with ST. The lack of clopidogrel therapy at the time of ST in the first 30 days after the index PCI (hazard ratio [HR]: 36.5, 95% confidence interval [CI]: 8.0 to 167.8), between 30 days and 6 months after the index PCI (HR: 4.6, 95% CI: 1.4 to 15.3), and beyond 6 months (HR: 5.9, 95% CI: 1.7 to 19.8) after the index PCI was strongly associated with ST.Important correlates of ST were identified. Discontinuation of clopidogrel, undersizing of the coronary stent, present malignancy, and intermediate (>or=50% to <70% stenosis) coronary artery disease proximal to the culprit lesion were the strongest predictors of ST.

Long-term in vivo imaging of Confetti-labelled Lgr5-expressing intestinal stem cells shows that a dynamically heterogeneous cell population is able to function long-term as an equipotent stem-cell pool. Inducible genetic labelling studies have previously shown that maintenance of the intestinal epithelium relies upon neutral competition between dividing stem cells. Jacco van Rheenen and colleagues used long-term in vivo imaging of Lgr5-expressing intestinal stem cells and confetti double-labelled intestinal crypt cells to achieve the first real-time observation of intestinal crypt stem cells undergoing proliferation, clonal expansion and neutral drift. Using this approach, the authors found that a dynamically heterogeneous cell population is able to function long-term as a single-stem-cell pool. The rapid turnover of the mammalian intestinal epithelium is supported by stem cells located around the base of the crypt1. In addition to the Lgr5 marker, intestinal stem cells have been associated with other markers that are expressed heterogeneously within the crypt base region1,2,3,4,5,6. Previous quantitative clonal fate analyses have led to the proposal that homeostasis occurs as the consequence of neutral competition between dividing stem cells7,8,9. However, the short-term behaviour of individual Lgr5+ cells positioned at different locations within the crypt base compartment has not been resolved. Here we establish the short-term dynamics of intestinal stem cells using the novel approach of continuous intravital imaging of Lgr5-Confetti mice. We find that Lgr5+ cells in the upper part of the niche (termed 'border cells') can be passively displaced into the transit-amplifying domain, after the division of proximate cells, implying that the determination of stem-cell fate can be uncoupled from division. Through quantitative analysis of individual clonal lineages, we show that stem cells at the crypt base, termed 'central cells', experience a survival advantage over border stem cells. However, through the transfer of stem cells between the border and central regions, all Lgr5+ cells are endowed with long-term self-renewal potential. These findings establish a novel paradigm for stem-cell maintenance in which a dynamically heterogeneous cell population is able to function long term as a single stem-cell pool.

Exosomes are specialized membranous nano-sized vesicles derived from endocytic compartments that are released by many cell types. Microvesicles are distinctive from exosomes in that they are produced by shedding of the plasmamembrane and usually larger in size (>1 µm). Exosome biogenesis involves the tightly controlled process of inward budding from the limiting membrane of multivesicular bodies (MVBs). This results in numerous intraluminal vesicles in the lumen of MVBs that contain distinct protein repertoires. It has been suggested that microvesicles shed by certain tumor cells hold functional messenger RNA (mRNA) that may promote tumor progression. We discovered that purified exosomes contain functional microRNAs (miRNAs) and small RNA, but detected little mRNA. Although a clear and decisive distinction between microvesicles and exosomes cannot be made and different subsets of exosomes exist, we speculate that exosomes are specialized in carrying small RNA including the class 22-25 nucleotide regulatory miRNAs. To demonstrate this we developed a co-culture system and found that exosomes are continuously secreted and transferred from Epstein Barr virus (EBV)-infected cells to uninfected neighboring cells. Throughout exosome transfer, the exogenous EBV-encoded miRNAs were delivered to subcellular sites of miRNA-mediated gene repression. Additionally, we found evidence that mature miRNAs are transferred between circulating cells in humans, since we detected EBV-miRNAs in non-infected cells in the peripheral blood of patients that include monocytes and T cells. In this addendum we discuss these findings in the context of recently published papers that advanced our current knowledge of exosome physiology, (mi)RNA function and intercellular RNA transfer. Based on this information we propose that an intercellular (miRNA-based) mode of signal transmission may be well suited in controlling space-confined processes such as the initiation of immune responses in the secondary (peripheral) lymphoid tissues or in a tumor microenvironment. Deciphering the molecular mechanism(s) that control small RNA loading into exosomes and transfer to recipient cells in vitro will provide new evidence for the physiological relevance of vesicle-mediated intercellular communication in vivo.

Exosomes are small endosome-derived extracellular vesicles implicated in cell–cell communication and are secreted by living cells when multivesicular bodies (MVBs) fuse with the plasma membrane (PM). Current techniques to study exosome physiology are based on isolation procedures after secretion, precluding direct and dynamic insight into the mechanics of exosome biogenesis and the regulation of their release. In this study, we propose real-time visualization of MVB–PM fusion to overcome these limitations. We designed tetraspanin-based pH-sensitive optical reporters that detect MVB–PM fusion using live total internal reflection fluorescence and dynamic correlative light–electron microscopy. Quantitative analysis demonstrates that MVB–PM fusion frequency is reduced by depleting the target membrane SNAREs SNAP23 and syntaxin-4 but also can be induced in single cells by stimulation of the histamine H1 receptor (H1HR). Interestingly, activation of H1R1 in HeLa cells increases Ser110 phosphorylation of SNAP23, promoting MVB–PM fusion and the release of CD63-enriched exosomes. Using this single-cell resolution approach, we highlight the modulatory dynamics of MVB exocytosis that will help to increase our understanding of exosome physiology and identify druggable targets in exosome-associated pathologies.

Abstract Intravital microscopy (IVM) enables live imaging of animals at single-cell level, offering essential insights into cancer progression. This technique allows for the observation of single-cell behaviors within their natural 3D tissue environments, shedding light on how genetic and microenvironmental changes influence the complex dynamics of tumors. The complexity of data generated by IVM often surpasses the capabilities of conventional analyses accessible to biomedical scientists, thereby neglecting single-cell heterogeneity and limiting the exploration of microenvironmental influences on cellular behavior without bias. To address this challenge, here we introduce BEHAV3D Tumor Profiler (BEHAV3D-TP), a user-friendly computational framework designed for the comprehensive analysis of single tumor cell behaviors and their interactions with the tumor microenvironment (TME). BEHAV3D-TP facilitates unbiased profiling of cancer cell dynamics without requiring advanced computational expertise. Here, we apply BEHAV3D-TP to study diffuse midline glioma (DMG), a highly aggressive pediatric brain tumor characterized by invasive growth. Our analysis reveals that distinct migratory behaviors of DMG cells correlate with specific TME components such as tumor-associated macrophages and vasculature. This approach, initially aimed at uncovering tumor invasive patterns and their interactions with the TME, holds promise for understanding additional cancer cell behaviors like intravasation and metastasis. BEHAV3D-TP represents a significant advancement in democratizing the analysis of heterogeneous cancer cell behaviors and their TME interactions, providing accessible computational insights into tumor dynamics.