Abstract A stereological method for obtaining estimates of the total number of neurons in five major subdivisions of the rat hippocampus is described. The new method, the optical fractionator, combines two recent developments in stereology: a three‐dimensional probe for counting neuronal nuclei, the optical disector, and a systematic uniform sampling scheme, the fractionator. The optical disector results in unbiased estimates of neuron number, i.e., estimates that are free of assumptions about neuron size and shape, are unaffected by lost caps and over‐projection, and approach the true number of neurons in an unlimited manner as the number of samples is increased. The fractionator involves sampling a known fraction of a structural component. In the case of neuron number, a zero dimensional quantity, it provides estimates that are unaffected by shrinkage before, during, and after processing of the tissue. Because the fractionator involves systematic sampling, it also results in highly efficient estimates. Typically only 100–200 neurons must be counted in an animal to obtain a precision that is compatible with experimental studies. The methodology is compared with those used in earlier works involving estimates of neuron number in the rat hippocampus and a number of new stereological methods that have particular relevance to the quantitative study of the structure of the nervous system are briefly described in an appendix.

The connectivity of cancellous bone attracts increasing attention, as it has been hypothesized that a primary reason for decreasing strength and stiffness in osteoporosis is caused by a loss of trabecular elements and consequently a loss in connectivity. The Euler characteristic has in a few previous articles been used to express cancellous bone connectivity, but there are severe problems in using the Euler characteristic uncritically. The Euler characteristic of a three-dimensional structure is a topological invariant, which reports the number of particles of a structure plus the number of enclosed cavities minus the connectivity. As such, one must know the number of components and the number of enclosed cavities in order to use the Euler characteristic as an expression of connectivity. Another difficulty of using the Euler characteristic is that due to edge effects the Euler characteristic of an excised specimen provides a biased estimate of the Euler characteristic of the region from which the specimen was taken. In this article the intuitive concept of connectivity is given a precise mathematical definition, and a basic topological method for quantifying the connectivity of cancellous bone is presented. The method uses the Euler characteristic, but the above-mentioned problems are controlled. The development of the method and the practical implementation is based on a set of topological notes. It must be stressed that the method is free from assumptions concerning trabecular architecture, and that the method is unbiased. This is in contrast to previously presented methods. The unbiased and model-free method is used on a series of 3-D reconstructions of cancellous bone specimens, and it is demonstrated that the connectivity of cancellous bone is not simply related to volume fraction (density), and that biased and model-based 2-D methods aimed at determining connectivity do not have any general relationship to connectivity in cancellous bone.

The usefulness of a number of new stereological principles for unbiased estimation of particle number and sizes and sampling of particles is illustrated together with a novel principle for unbiased estimation of anisotropic surfaces. The examples include descriptions of estimators of neurone and synapse number and sizes, synapse gradients, neurone point patterns in three-dimensional space, capillary surface area, and perikarya volumes. A major advantage of the methods is the possibility to carry out the estimation procedures in specified, well-characterized regions or layers of the brain. Some general statistical and stereological problems are briefly discussed.

SUMMARY A new, fundamental stereological principle is described which allows unbiased estimates of absolute structural quantities in arbitrarily shaped structures to be made from observations sampled in arbitrary points on independently isotropic probes. As an introduction to the principle, method(s) are described which lead to assumption‐free estimates of mean volume from the usual number‐distribution of particle sizes. Specifically, the estimation is unbiased when arbitrarily shaped particles are sampled with uniform probability using the disector or one of its many modifications. A special case, of interest when observations are restricted to sections, occurs when the particles are associated with some recognizable unit, like eukaryotic cells in biology. The estimation may then be carried out on a few sections of unknown thickness, or—under verifiable assumptions—on just one random section.

Using an unbiased stereological technique, the total numbers of pigmented and non-pigmented neurons were estimated in the substantia nigra of seven patients with Parkinson9s disease and seven control patients. Compared with the controls, in which the average total number of pigmented neurons was 550,000, the number of neurons was reduced by 66% in the patients. The average total number of non-pigmented neurons was 260,000 in controls and reduced by 24% in the patients. A significant correlation (r = 0.81) existed between the total numbers of pigmented and non-pigmented neurons in the controls, whereas a similar correlation (r = 0.72) in the patients fell just short of statistical significance. The stereological estimates made in this study are unbiased, in that they are independent of nerve cell size, section thickness and of dimensional changes in brain tissue induced by histological procedures. The stereological method is considerably more efficient than previous conventional methods.