Abstract The beta-coronavirus SARS-CoV-2 is at the origin of a persistent worldwide pandemic. SARS-CoV-2 infections initiate in the bronchi of the upper respiratory tract and are able to disseminate to the lower respiratory tract eventually causing acute severe respiratory syndrome with a high degree of mortality in the elderly. Here we use reconstituted primary bronchial epithelia from adult and children donors to follow the infection dynamic following infection with SARS-CoV-2. We show that in bronchial epithelia derived from adult donors, infections initiate in multi-ciliated cells. Then, infection rapidly spread within 24-48h throughout the whole epithelia. Within 3-4 days, large apical syncytia form between multi-ciliated cells and basal cells, which dissipate into the apical lumen. We show that these syncytia are a significant source of the released infectious dose. In stark contrast to these findings, bronchial epithelia reconstituted from children donors are intrinsically more resistant to virus infection and show active restriction of virus spread. This restriction is paired with accelerated release of IFN compared to adult donors. Taken together our findings reveal apical syncytia formation as an underappreciated source of infectious virus for either local dissemination or release into the environment. Furthermore, we provide direct evidence that children bronchial epithelia are more resistant to infection with SARS-CoV-2 providing experimental support for epidemiological observations that SARS-CoV-2 cases’ fatality is linked to age. Significance Statement Bronchial epithelia are the primary target for SARS-CoV-2 infections. Our work uses reconstituted bronchial epithelia from adults and children. We show that infection of adult epithelia with SARS-CoV-2 is rapid and results in the synchronized release of large clusters of infected cells and syncytia into the apical lumen contributing to the released infectious virus dose. Infection of children derived bronchial epithelia revealed an intrinsic resistance to infection and virus spread, probably as a result of a faster onset of interferon secretion. Thus, our data provide direct evidence for the epidemiological observation that children are less susceptible to SARS-CoV-2.

BILBO1 was the first characterized component of the flagellar pocket collar (FPC) in trypanosomes. The N-terminal domain (NTD) of BILBO1 plays an essential role in Trypanosoma brucei FPC biogenesis and is thus vital for the parasite’s survival. Here we report a 1.6-Å resolution crystal structure of TbBILBO1-NTD, which revealed a conserved horseshoe-like hydrophobic pocket formed by an unusually long loop. Mutagenesis studies suggested that another FPC protein, FPC4, interacts with TbBILBO1 via mainly contacting the three conserved aromatic residues W71, Y87 and F89 at the center of this pocket. Overall, we have determined the binding site of TbFPC4 on TbBILBO1-NTD, which may provide a basis for rational drug design in the future.

Glycosomes are peroxisome-related organelles that compartmentalise the glycolytic enzymes in kinetoplastid parasites. These organelles are developmentally regulated in their number and composition, allowing metabolic adaptation to the parasite's needs in the blood of mammalian hosts or within their arthropod vector. A protein phosphatase cascade regulates differentiation between parasite developmental forms, comprising a tyrosine phosphatase, TbPTP1, that dephosphorylates and inhibits a serine threonine phosphatase TbPIP39 that promotes differentiation. When TbPTP1 is inactivated, TbPIP39 is activated and during differentiation becomes located in glycosomes. Here we have tracked TbPIP39 recruitment to glycosomes during differentiation from bloodstream stumpy forms to procyclic forms. Detailed microscopy and live cell imaging during the synchronous transition between life cycle stages revealed that in stumpy forms, TbPIP39 is located at a periflagellar pocket site closely associated with TbVAP, that defines the flagellar pocket endoplasmic reticulum. TbPTP1 is also located at the same site in stumpy forms, as is REG9.1, a regulator of stumpy-enriched mRNAs. This site provides a molecular node for the interaction between TbPTP1 and TbPIP39. Within 30 minutes of the initiation of differentiation TbPIP39 relocates to glycosomes whereas TbPTP1 disperses to the cytosol. Overall, the study identifies a 'stumpy regulatory nexus' (STuRN) that co-ordinates the molecular components of life cycle signalling and glycosomal development during transmission of Trypanosoma brucei.

SUMMARY Kinetoplastids are unicellular eukaryotic flagellated parasites found in a wide range of hosts within the animal and plant kingdoms. They are known to be responsible in humans for African sleeping sickness ( Trypanosoma brucei ), Chagas disease ( Trypanosoma cruzi ), and various forms of leishmaniasis ( Leishmania spp.), as well as several animal diseases with important economic impact (African trypanosomes, including T. congolense ). Understanding the biology of these parasites necessarily implies the ability to manipulate their genomes. In this study, we demonstrate that transfection of a ribonucleoprotein complex, composed of recombinant Streptococcus pyogenes Cas9 ( Sp Cas9) and an in vitro -synthesized guide RNA, results in rapid and efficient genetic modifications of trypanosomatids, in marker-free conditions. This approach was successfully developed to inactivate, delete and mutate candidate genes in various stages of the life cycle of T. brucei and T. congolense , and Leishmania promastigotes. The functionality of Sp Cas9 in these parasites now provides, to the research community working on these parasites, a rapid and efficient method of genome editing, without requiring plasmid construction and selection by antibiotics. Importantly, this approach is adaptable to any wild-type parasite, including field isolates.

ABSTRACT Male infertility is common and complex, presenting a wide range of heterogeneous phenotypes. Although about 50% of cases are estimated to have a genetic component, the underlying cause often remains undetermined. Here, from whole-exome sequencing on samples from 168 infertile men with asthenoteratozoospermia due to severe sperm flagellum, we identified homozygous ZMYND12 variants in four unrelated patients. In sperm cells from these individuals, immunofluorescence revealed altered localization of DNAH1, DNALI1, WDR66 and TTC29. Axonemal localization of ZMYND12 ortholog TbTAX-1 was confirmed using the Trypanosoma brucei model. RNAi knock-down of TbTAX-1 dramatically affected flagellar motility, with a phenotype similar to the sperm from men bearing homozygous ZMYND12 variants. Co-immunoprecipitation and ultrastructure expansion microscopy in T. brucei revealed TbTAX-1 to form a complex with TTC29. Comparative proteomics with samples from Trypanosoma and Ttc29 KO mice identified a third member of this complex: DNAH1. The data presented revealed that ZMYND12 is part of the same axonemal complex as TTC29 and DNAH1, which is critical for flagellum function and assembly in humans, and Trypanosoma. ZMYND12 is thus a new asthenoteratozoospermia-associated gene, bi-allelic variants of which cause severe flagellum malformations and primary male infertility.

Abstract The flagellar pocket (FP) is the only endo- and exocytic organelle in most trypanosomes and, as such, is essential throughout the life cycle of the parasite. The neck of the FP is maintained enclosed around the flagellum via the flagellar pocket collar (FPC). The FPC is a macromolecular cytoskeletal structure and is essential for the formation of the FP and cytokinesis. FPC biogenesis and structure are poorly understood, mainly due to the lack of information on FPC composition. To date, only two FPC proteins, BILBO1 and FPC4, have been characterized. BILBO1 forms a molecular skeleton upon which other FPC proteins can, theoretically, dock onto. We previously identified FPC4 as the first BILBO1 interacting partner and demonstrated that its C-terminal domain interacts with the BILBO1 N-terminal domain (NTD). Here, we report the characterization of a new FPC component and BILBO1 partner protein, BILBO2 (Tb927.6.3240) by yeast two-hybrid screen, bioinformatics, functional and structural studies. We show that BILBO2 colocalizes with BILBO1 and can modulate the shape of the BILBO1 filament by interacting with the BILBO1 EF-hand domains. Further, we demonstrate that BILBO1 and BILBO2 share a homologous NTD domain and that both domains interact with FPC4. We have determined a 1.9 Å resolution crystal structure of the BILBO2 NTD in complex with the FPC4 BILBO1-binding domain. Together with mutational analyses, our studies reveal key residues for the function of the BILBO2 NTD and its interaction with FPC4 and evidenced a tripartite interaction between BILBO1, BILBO2, and FPC4. Our work sheds light on the first atomic structure of an FPC protein complex and represents a significant step in deciphering the FPC function in Trypanosoma brucei and other pathogenic kinetoplastids. Author summary Trypanosomes belong to a group of zoonotic, protist, parasites that are found in Africa, Asia, South America, and Europe and are responsible for severe human and animal diseases. They all have a common structure called the flagellar pocket (FP). In most trypanosomes, all macromolecular exchanges between the trypanosome and the environment occur via the FP. The FP is thus essential for cell viability and evading the host immune response. We have been studying the flagellar pocket collar (FPC), an enigmatic macromolecular structure at the neck of the FP, and demonstrated its essentiality for the biogenesis of the FP. We demonstrated that BILBO1 is an essential protein of the FPC that interacts with other proteins including a microtubule-binding protein FPC4. Here we identify another bona fide FPC protein, BILBO2, so named because of close similarity with BILBO1 in protein organization and functional domains. We demonstrate that BILBO1 and BILBO2 share a common N-terminal domain involved in the interaction with FPC4, and illustrate a tripartite interaction between BILBO1, BILBO2, and FPC4. Our study also provides the first atomic view of two FPC components. These data represent an additional step in deciphering the FPC structure and function in T. brucei .

Abstract Trypanosoma brucei belongs to a genus of protists that cause life-threatening and economically important diseases of human and animal populations in Sub-Saharan Africa . T. brucei cells are covered in surface glycoproteins some of which are used to escape the host immune system. Exo-/endocytotic trafficking of these and other molecules occurs via a single copy organelle called the flagellar pocket (FP). The FP is maintained and enclosed around the flagellum by the flagellar pocket collar (FPC). To date, the most important cytoskeletal component of the FPC is an essential, calcium-binding, polymer-forming protein called Tb BILBO1. In searching for novel immune-tools to study this protein, we raised nanobodies against Tb BILBO1. Nanobodies (Nb) that were selected according to their binding properties to Tb BILBO1, were tested as immunofluorescence tools, and expressed as intrabodies (INb). One of them, Nb48, proved to be the most robust nanobody and intrabody. We further demonstrate that inducible, cytoplasmic expression of INb48 was lethal to these parasites, producing abnormal phenotypes resembling those of Tb BILBO1 RNAi knockdown. Our results validate the feasibility of generating functional single-domain antibody derived intrabodies to target trypanosome cytoskeleton proteins.