Binding of human growth hormone (hGH) to its receptor is required for regulation of normal human growth and development. Examination of the 2.8 angstrom crystal structure of the complex between the hormone and the extracellular domain of its receptor (hGHbp) showed that the complex consists of one molecule of growth hormone per two molecules of receptor. The hormone is a four-helix bundle with an unusual topology. The binding protein contains two distinct domains, similar in some respects to immunoglobulin domains. The relative orientation of these domains differs from that found between constant and variable domains in immunoglobulin Fab fragments. Both hGHbp domains contribute residues that participate in hGH binding. In the complex both receptors donate essentially the same residues to interact with the hormone, even though the two binding sites on hGH have no structural similarity. Generally, the hormone-receptor interfaces match those identified by previous mutational analyses. In addition to the hormone-receptor interfaces, there is also a substantial contact surface between the carboxyl-terminal domains of the receptors. The relative extents of the contact areas support a sequential mechanism for dimerization that may be crucial for signal transduction.

Abstract

 We have determined the 3.2 Å X-ray crystal structure of the extracellular domain of the human epidermal growth factor receptor 2 (ErbB2 or HER2) in a complex with the antigen binding fragment of pertuzumab, an anti-ErbB2 monoclonal antibody also known as 2C4 or Omnitarg. Pertuzumab binds to ErbB2 near the center of domain II, sterically blocking a binding pocket necessary for receptor dimerization and signaling. The ErbB2-pertuzumab structure, combined with earlier mutagenesis data, defines the pertuzumab residues essential for ErbB2 interaction. To analyze the ErbB2 side of the interface, we have mutated a number of residues contacting pertuzumab and examined the effects of these mutations on pertuzumab binding and ErbB2-ErbB3 heterodimerization. We have also shown that conserved residues previously shown to be necessary for EGF receptor homodimerization may be dispensible for ErbB2-ErbB3 heterodimerization.

Human growth hormone (hGH) forms a 1:2 complex with the extracellular domain of its receptor-binding protein (hGHbp) as studied by crystallization, size exclusion chromatography, calorimetry, and a previously undescribed fluorescence quenching assay. These and other experiments with protein engineered variants of hGH have led to the identification of the binding determinants for two distinct but adjacent sites on hGH for the hGHbp, and the data indicated that there are two overlapping binding sites on the hGHbp for hGH. Furthermore, the binding of hGH to the hGHbp occurred sequentially; a first hGHbp molecule bound to site 1 on hGH and then a second hGHbp bound to site 2. Hormone-induced receptor dimerization is proposed to be relevant to the signal transduction mechanism for the hGH receptor and other related cytokine receptors.

The crystal structure at 2.7 Å resolution of the normal human c-H- ras oncogene protein lacking a flexible carboxyl-terminal 18 residue reveals that the protein consists of a six-stranded β sheet, four α helices, and nine connecting loops. Four loops are involved in interactions with bound guanosine diphosphate: one with the phosphates, another with the ribose, and two with the guanine base. Most of the transforming proteins (in vivo and in vitro) have single amino acid substitutions at one of a few key positions in three of these four loops plus one additional loop. The biological functions of the remaining five loops and other exposed regions are at present unknown. However, one loop corresponds to the binding site for a neutralizing monoclonal antibody and another to a putative "effector region"; mutations in the latter region do not alter guanine nucleotide binding or guanosine triphosphatase activity but they do reduce the transforming activity of activated proteins. The data provide a structural basis for understanding the known biochemical properties of normal as well as activated ras oncogene proteins and indicate additional regions in the molecule that may possibly participate in other cellular functions.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a homodimeric hormone that induces proliferation of endothelial cells through binding to the kinase domain receptor and the Fms-like tyrosine kinase receptor (Flt-1), the extracellular portions of which consist of seven immunoglobulin domains. We show that the second and third domains of Flt-1 are necessary and sufficient for binding VEGF with near-native affinity, and that domain 2 alone binds only 60-fold less tightly than wild-type. The crystal structure of the complex between VEGF and the second domain of Flt-1 shows domain 2 in a predominantly hydrophobic interaction with the "poles" of the VEGF dimer. Based on this structure and on mutational data, we present a model of VEGF bound to the first four domains of Flt-1.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a homodimeric member of the cystine knot family of growth factors, with limited sequence homology to platelet-derived growth factor (PDGF) and transforming growth factor beta2 (TGF-beta). We have determined its crystal structure at a resolution of 2.5 A, and identified its kinase domain receptor (KDR) binding site using mutational analysis. Overall, the VEGF monomer resembles that of PDGF, but its N-terminal segment is helical rather than extended. The dimerization mode of VEGF is similar to that of PDGF and very different from that of TGF-beta. Mutational analysis of VEGF reveals that symmetrical binding sites for KDR are located at each pole of the VEGF homodimer. Each site contains two functional "hot spots" composed of binding determinants presented across the subunit interface. The two most important determinants are located within the largest hot spot on a short, three-stranded sheet that is conserved in PDGF and TGF-beta. Functional analysis of the binding epitopes for two receptor-blocking antibodies reveal different binding determinants near each of the KDR binding hot spots.

Formation of a complex between Apo2L (also called TRAIL) and its signaling receptors, DR4 and DR5, triggers apoptosis by inducing the oligomerization of intracellular death domains. We report the crystal structure of the complex between Apo2L and the ectodomain of DR5. The structure shows three elongated receptors snuggled into long crevices between pairs of monomers of the homotrimeric ligand. The interface is divided into two distinct patches, one near the bottom of the complex close to the receptor cell surface and one near the top. Both patches contain residues that are critical for high-affinity binding. A comparison to the structure of the lymphotoxin-receptor complex suggests general principles of binding and specificity for ligand recognition in the TNF receptor superfamily.