Whether evolution is erratic due to random historical details, or is repeatedly directed along similar paths by certain constraints, remains unclear. Epistasis (i.e. non-additive interaction between mutations that affect fitness) is a mechanism that can contribute to both scenarios. Epistasis can constrain the type and order of selected mutations, but it can also make adaptive trajectories contingent upon the first random substitution. This effect is particularly strong under sign epistasis, when the sign of the fitness effects of a mutation depends on its genetic background. In the current study, we examine how epistatic interactions between mutations determine alternative evolutionary pathways, using in vitro evolution of the antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase. First, we describe the diversity of adaptive pathways among replicate lines during evolution for resistance to a novel antibiotic (cefotaxime). Consistent with the prediction of epistatic constraints, most lines increased resistance by acquiring three mutations in a fixed order. However, a few lines deviated from this pattern. Next, to test whether negative interactions between alternative initial substitutions drive this divergence, alleles containing initial substitutions from the deviating lines were evolved under identical conditions. Indeed, these alternative initial substitutions consistently led to lower adaptive peaks, involving more and other substitutions than those observed in the common pathway. We found that a combination of decreased enzymatic activity and lower folding cooperativity underlies negative sign epistasis in the clash between key mutations in the common and deviating lines (Gly238Ser and Arg164Ser, respectively). Our results demonstrate that epistasis contributes to contingency in protein evolution by amplifying the selective consequences of random mutations.

The concept of a fitness landscape is a powerful metaphor that offers insight into various aspects of evolutionary processes and guidance for the study of evolution. Until recently, empirical evidence on the ruggedness of these landscapes was lacking, but since it became feasible to construct all possible genotypes containing combinations of a limited set of mutations, the number of studies has grown to a point where a classification of landscapes becomes possible. The aim of this review is to identify measures of epistasis that allow a meaningful comparison of fitness landscapes and then apply them to the empirical landscapes to discern factors that affect ruggedness. The various measures of epistasis that have been proposed in the literature appear to be equivalent. Our comparison shows that the ruggedness of the empirical landscape is affected by whether the included mutations are beneficial or deleterious and by whether intra- or intergenic epistasis is involved. Finally, the empirical landscapes are compared to landscapes generated with the Rough Mt.\ Fuji model. Despite the simplicity of this model, it captures the features of the experimental landscapes remarkably well.

Abstract For a better understanding of the evolution of antibiotic resistance, it is imperative to study the factors that determine the initial establishment of mutant resistance alleles. In addition to the antibiotic concentration, the establishment of resistance alleles may be affected by interactions with the surrounding susceptible cells from which they derive, for instance via the release of nutrients or removal of the antibiotic. Here, we investigate the effects of social interactions with surrounding susceptible cells on the establishment of Escherichia coli mutants with increasing β-lactamase activity (i.e. the capacity to hydrolyze β-lactam antibiotics) from single cells under the exposure of the antibiotic cefotaxime on agar plates. We find that mutant establishment probability is increased in the presence of susceptible cells due to the active breakdown of the antibiotic, but the rate of breakdown by the susceptible strain is much higher than expected based on its low enzymatic activity. A detailed theoretical model suggests that this observation can be explained by cell filamentation causing delayed lysis. While susceptible cells may hamper the spread of higher-resistant β-lactamase mutants at relatively high frequencies, our findings show that they could promote establishment during their emergence.

Abstract For antibiotic resistance to arise, new resistant mutants must establish in a bacterial population before they can spread via natural selection. Comprehending the stochastic factors that influence mutant establishment is crucial for a quantitative understanding of antibiotic resistance emergence. Here, we quantify the single-cell establishment probability of four Escherichia coli strains expressing β-lactamase alleles with different activity against the antibiotic cefotaxime, as a function of antibiotic concentration in both unstructured (liquid) and structured (agar) environments. We show that concentrations well below the minimum inhibitory concentration (MIC) can substantially hamper establishment, particularly for highly resistant mutants. While the pattern of establishment suppression is comparable in both tested environments, we find greater variability in establishment probability on agar. Using a simple branching model, we investigate possible sources of this stochasticity, including environment-dependent lineage variability. Lastly, we use the single-cell establishment probability to predict each strain’s MIC in the absence of social interactions. We observe substantially higher measured than predicted MIC values, particularly for highly resistant strains, which indicates cooperative effects among resistant cells at large cell numbers, such as in standard MIC assays.

Whether evolution can be predicted is a key question in evolutionary biology. Here we set out to better understand the repeatability of evolution, which is a necessary condition for predictability. We explored experimentally the effect of mutation supply and the strength of selective pressure on the repeatability of selection from standing genetic variation. Different sizes of mutant libraries of an antibiotic resistance gene, TEM-1 β-lactamase in Escherichia coli, were subjected to different antibiotic concentrations. We determined whether populations went extinct or survived, and sequenced the TEM gene of the surviving populations. The distribution of mutations per allele in our mutant libraries-generated by error-prone PCR-followed a Poisson distribution. Extinction patterns could be explained by a simple stochastic model that assumed the sampling of beneficial mutations was key for survival. In most surviving populations, alleles containing at least one known large-effect beneficial mutation were present. These genotype data also support a model which only invokes sampling effects to describe the occurrence of alleles containing large-effect driver mutations. Hence, evolution is largely predictable given cursory knowledge of mutational fitness effects, the mutation rate and population size. There were no clear trends in the repeatability of selected mutants when we considered all mutations present. However, when only known large-effect mutations were considered, the outcome of selection is less repeatable for large libraries, in contrast to expectations. Furthermore, we show experimentally that alleles carrying multiple mutations selected from large libraries confer higher resistance levels relative to alleles with only a known large-effect mutation, suggesting that the scarcity of high-resistance alleles carrying multiple mutations may contribute to the decrease in repeatability at large library sizes.

Abstract Adaptive evolutionary processes are constrained by the availability of mutations which cause a fitness benefit – a concept that may be illustrated by ‘fitness landscapes’ which map the relationship of genotype space with fitness. Experimentally derived landscapes have demonstrated a predictability to evolution by identifying limited ‘mutational routes’ that evolution by natural selection may take between low and high-fitness genotypes. However, such studies often utilise indirect measures to determine fitness. We estimated the competitive fitness of each mutant relative to all of its single-mutation neighbours to describe the fitness landscape of three mutations in a β-lactamase enzyme at sub-lethal concentrations of the antibiotic cefotaxime in a structured and unstructured environment. We found that in the unstructured environment the antibiotic selected for higher-resistance types – but with an equivalent fitness for subsets of mutants, despite substantial variation in resistance – resulting in a stratified fitness landscape. In contrast, in a structured environment with low antibiotic concentration, antibiotic-susceptible genotypes had a relative fitness advantage, which was associated with antibiotic-induced filamentation. These results cast doubt that highly resistant genotypes have a unique selective advantage in environments with sub-inhibitory concentrations of antibiotics, and demonstrate that direct fitness measures are required for meaningful predictions of the accessibility of evolutionary routes. Importance The evolution of antibiotic resistant bacterial populations underpins the ongoing antibiotic-resistance crisis. We aim to understand how antibiotic-degrading enzymes can evolve to cause increased resistance, how this process is constrained and whether it can be predictable. To this end we performed competition experiments with a combinatorially-complete set of mutants of a β-lactamase gene subject to sub-inhibitory concentrations of the antibiotic cefotaxime. While some mutants confer their hosts with high resistance to cefotaxime, in competition these mutants do not always confer a selective advantage. Similarly, we identified conditions involving spatial structure where mutations causing high resistance result in a selective disadvantage. Together, this work suggests that the relationship between resistance level and fitness at sub-inhibitory concentrations is complex; predicting the evolution of antibiotic resistance requires knowledge of the conditions that select for resistant genotypes and the selective advantage evolved types have over their predecessors.