The membrane raft hypothesis postulates the existence of lipid bilayer membrane heterogeneities, or domains, supposed to be important for cellular function, including lateral sorting, signaling, and trafficking. Characterization of membrane lipid heterogeneities in live cells has been challenging in part because inhomogeneity has not usually been definable by optical microscopy. Model membrane systems, including giant unilamellar vesicles, allow optical fluorescence discrimination of coexisting lipid phase types, but thus far have focused on coexisting optically resolvable fluid phases in simple lipid mixtures. Here we demonstrate that giant plasma membrane vesicles (GPMVs) or blebs formed from the plasma membranes of cultured mammalian cells can also segregate into micrometer-scale fluid phase domains. Phase segregation temperatures are widely spread, with the vast majority of GPMVs found to form optically resolvable domains only at temperatures below ≈25°C. At 37°C, these GPMV membranes are almost exclusively optically homogenous. At room temperature, we find diagnostic lipid phase fluorophore partitioning preferences in GPMVs analogous to the partitioning behavior now established in model membrane systems with liquid-ordered and liquid-disordered fluid phase coexistence. We image these GPMVs for direct visual characterization of protein partitioning between coexisting liquid-ordered-like and liquid-disordered-like membrane phases in the absence of detergent perturbation. For example, we find that the transmembrane IgE receptor FcεRI preferentially segregates into liquid-disordered-like phases, and we report the partitioning of additional well known membrane associated proteins. Thus, GPMVs now provide an effective approach to characterize biological membrane heterogeneities.

Tumor progression involves the ability of cancer cells to communicate with each other and with neighboring normal cells in their microenvironment. Microvesicles (MV) derived from human cancer cells have received a good deal of attention because of their ability to participate in the horizontal transfer of signaling proteins between cancer cells and to contribute to their invasive activity. Here we show that MV may play another important role in oncogenesis. In particular, we demonstrate that MV shed by two different human cancer cells, MDAMB231 breast carcinoma cells and U87 glioma cells, are capable of conferring onto normal fibroblasts and epithelial cells the transformed characteristics of cancer cells (e.g., anchorage-independent growth and enhanced survival capability) and that this effect requires the transfer of the protein cross-linking enzyme tissue transglutaminase (tTG). We further demonstrate that tTG is not sufficient to transform fibroblasts but rather that it must collaborate with another protein to mediate the transforming actions of the cancer cell-derived MV. Proteomic analyses of the MV derived from MDAMB231 and U87 cells indicated that both these vesicle preparations contained the tTG-binding partner and cross-inking substrate fibronectin (FN). Moreover, we found that tTG cross-links FN in MV from cancer cells and that the ensuing MV-mediated transfers of cross-linked FN and tTG to recipient fibroblasts function cooperatively to activate mitogenic signaling activities and to induce their transformation. These findings highlight a role for MV in the induction of cellular transformation and identify tTG and FN as essential participants in this process.

We present an analytical method using correlation functions to quantify clustering in super-resolution fluorescence localization images and electron microscopy images of static surfaces in two dimensions. We use this method to quantify how over-counting of labeled molecules contributes to apparent self-clustering and to calculate the effective lateral resolution of an image. This treatment applies to distributions of proteins and lipids in cell membranes, where there is significant interest in using electron microscopy and super-resolution fluorescence localization techniques to probe membrane heterogeneity. When images are quantified using pair auto-correlation functions, the magnitude of apparent clustering arising from over-counting varies inversely with the surface density of labeled molecules and does not depend on the number of times an average molecule is counted. In contrast, we demonstrate that over-counting does not give rise to apparent co-clustering in double label experiments when pair cross-correlation functions are measured. We apply our analytical method to quantify the distribution of the IgE receptor (FcεRI) on the plasma membranes of chemically fixed RBL-2H3 mast cells from images acquired using stochastic optical reconstruction microscopy (STORM/dSTORM) and scanning electron microscopy (SEM). We find that apparent clustering of FcεRI-bound IgE is dominated by over-counting labels on individual complexes when IgE is directly conjugated to organic fluorophores. We verify this observation by measuring pair cross-correlation functions between two distinguishably labeled pools of IgE-FcεRI on the cell surface using both imaging methods. After correcting for over-counting, we observe weak but significant self-clustering of IgE-FcεRI in fluorescence localization measurements, and no residual self-clustering as detected with SEM. We also apply this method to quantify IgE-FcεRI redistribution after deliberate clustering by crosslinking with two distinct trivalent ligands of defined architectures, and we evaluate contributions from both over-counting of labels and redistribution of proteins.

Alpha synuclein (a-syn) is an intrinsically disordered protein prevalent in neurons, and aggregated forms are associated with synucleinopathies including Parkinson' disease (PD). Despite the biomedical importance and extensive studies, the physiological role of a-syn and its participation in etiology of PD remain uncertain. We showed previously in model RBL cells that a-syn colocalizes with mitochondrial membranes, depending on formation of N-terminal helices and increasing with mitochondrial stress. 1 We have now characterized this colocalization and functional correlates in RBL, HEK293, and N2a cells. We find that expression of a-syn enhances stimulated mitochondrial uptake of Ca 2+ from the ER, depending on formation of its N-terminal helices but not on its disordered C-terminal tail. Our results are consistent with a-syn acting as a tether between mitochondria and ER, and we show increased contacts between these two organelles using structured illumination microscopy. We tested mitochondrial stress caused by toxins related to PD, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP/MPP+) and carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), and found that a-syn prevents recovery of stimulated mitochondrial Ca 2+ uptake. The C-terminal tail, and not N-terminal helices, is involved in this inhibitory activity, which is abrogated when phosphorylation site serine-129 is mutated (S129A). Correspondingly, we find that MPTP/MPP+ and CCCP stress is accompanied by both phosphorylation (pS129) and aggregation of a-syn. Overall, our results indicate that a-syn can participate as a tethering protein to modulate Ca 2+ flux between ER and mitochondria, with potential physiological significance. A-syn can also prevent cellular recovery from toxin-induced mitochondrial dysfunction, which may represent a pathological role of a-syn in the etiology of PD.

ABSTRACT Plasma membrane hosts numerous receptors, sensors, and ion channels involved in cellular signaling. Phase separation of the plasma membrane is emerging as a key biophysical regulator of signaling reactions in multiple physiological and pathological contexts. There is much evidence that plasma membrane composition supports the co-existence liquid-ordered (Lo) and liquid-disordered (Ld) phases or domains at physiological conditions. However, this phase/domain separation is nanoscopic and transient in live cells. It is recently proposed that transbilayer coupling between the inner and outer leaflets of the plasma membrane is driven by their asymmetric lipid distribution and by dynamic cytoskeleton-lipid composites that contribute to the formation and transience of Lo/Ld phase separation in live cells. In this Perspective, we highlight new approaches to investigate how transbilayer coupling may influence phase separation. For quantitative evaluation of the impact of these interactions, we introduce an experimental strategy centered around Imaging Fluorescence Correlation Spectroscopy (ImFCS), which measures membrane diffusion with very high precision. To demonstrate this strategy we choose two well-established model systems for transbilayer interactions: crosslinking by multivalent antigen of immunoglobulin E bound to receptor FcεRI, and crosslinking by cholera toxin B of GM1 gangliosides. We discuss emerging methods to systematically perturb membrane lipid composition, particularly exchange of outer leaflet lipids with exogenous lipids using methyl alpha cyclodextrin. These selective perturbations may be quantitatively evaluated with ImFCS and other high-resolution biophysical tools to discover novel principles of lipid-mediated phase separation in live cells in the context of their pathophysiological relevance.

A myriad of transient, nanoscopic lipid- and protein-based interactions confer a steady-state organization of plasma membrane in resting cells that is poised to orchestrate assembly of key signaling components upon reception of an extracellular stimulus. Although difficult to observe directly in live cells, these subtle interactions can be discerned by their impact on the diffusion of membrane constituents. Herein, we quantified the diffusion properties of a panel of structurally distinct lipid-anchored and transmembrane (TM) probes in RBL mast cells by multiplexed Imaging Fluorescence Correlation Spectroscopy. We developed a statistical analysis of data combined from many pixels over multiple cells to characterize differences as small as 10% in diffusion coefficients, which reflect differences in underlying interactions. We found that the distinctive diffusion properties of lipid-anchored probes can be explained by their dynamic partitioning into ordered proteo-lipid nanodomains, which encompass a major fraction of the membrane and whose physical properties are influenced by actin polymerization. Effects on diffusion by functional protein modules in both lipid-anchored and TM probes reflect additional complexity in steady-state membrane organization. The contrast we observe between different probes diffusing through the same membrane milieu represent the dynamic resting steady-state, which serves as a baseline for monitoring plasma membrane remodeling that occurs upon stimulation.

ABSTRACT Antigen (Ag) crosslinking of immunoglobulin E-receptor (IgE-FcεRI) complexes in mast cells stimulates transmembrane (TM) signaling, requiring phosphorylation of the clustered FcεRI by lipid-anchored Lyn tyrosine kinase. Previous studies showed that this stimulated coupling between Lyn and FcεRI occurs in liquid ordered (Lo)-like nanodomains of the plasma membrane and that Lyn binds directly to cytosolic segments of FcεRI that it initially phosphorylates for amplified activity. Net phosphorylation above a non-functional threshold is achieved in the stimulated state, but not in the resting state, and current evidence supports the hypothesis that this relies on disruption by Ag-crosslinking of a balance between Lyn and tyrosine phosphatase activities. However, the structural interactions that underlie the stimulation process remain poorly defined. This study evaluates the relative contributions and functional importance of different types of interactions leading to supra-threshold phosphorylation of Ag-crosslinked IgE-FcεRI in live rat basophilic leukemia (RBL) mast cells. Our high-precision diffusion measurements by Imaging Fluorescence Correlation Spectroscopy (ImFCS) on multiple structural variants of Lyn and other lipid-anchored probes confirm subtle, stimulated stabilization of the Lo-like nanodomains and concomitant sharpening of segregation from liquid-disordered (Ld)-like regions. With other structural variants we determine that lipid-based interactions are essential for access by Lyn leading to phosphorylation of and protein-based binding to clustered FcεRI. By contrast, TM tyrosine phosphatase, PTPα, is excluded from these regions by steric repulsion of TM segments and preference for Ld-like regions. Overall, we establish a synergy of lipid-based, protein-based, and steric interactions underlying functional TM signaling in mast cells. SIGNIFICANCE STATEMENT Lipid organization of the plasma membrane is known to be important for facilitating protein interactions in transmembrane signaling. However, the orchestration of these interactions in live cells has been elusive. We employed ImFCS to systemically investigate the interplay of lipids and proteins during signaling in mast cells, initiated as phosphorylation of Ag-crosslinked IgE-FcεRI by lipid-anchored Lyn kinase. We find lipid-based interactions are first required for protein-based phosphorylation of the clustered FcεRI within Lo-like nanodomains. Transmembrane phosphatases must be excluded from these regions, and we find this is mediated by their preference for Ld-like regions and by steric exclusion from the clustered FcεRI proteins. ImFCS provides quantitative characterization of the functional link between features of plasma membrane organization and transmembrane signaling.