Abstract Cell-free RNA, including both long RNA and small RNA, has been considered important for its biological functions and potential clinical usage, but the major challenge is to effectively sequence them at the same time. Here we present PolyAdenylation Ligation Mediated-Seq (PALM-Seq), an integrated sequencing method for cell-free long and small RNA. Through terminal modification and addition of 3’ polyadenylation and 5’ adaptor, we could get mRNA, long non-coding RNA, microRNA, tRNA, piRNA and other RNAs in a single library. With target RNA depletion, all these RNAs could be sequenced with relatively low depth. Using PALM-Seq, we identified pregnant-related mRNAs, long non-coding RNAs and microRNAs in female plasma. We also applied PALM-Seq to sequence RNA from amniotic fluids, leukocytes and placentas, and could find RNA signatures associated with specific sample type. PALM-Seq provides an integrated, cost-effective and simple method to characterize the landscape of cell-free RNA, and can stimulate further progress in cell-free RNA study and usage.

BACKGROUND: Research on peripheral leukocyte gene expression in human health and disease is growing rapidly. However, how to process sample efficiently, simply and stably, and how to reflect human physiological state preferably remains critical issues in large cohort studies. METHODS: We used RNA-seq to explore the differences of gene expression profiles among whole blood (WB) and three groups of leukocytes from buffy coat (BC) extraction, red blood cell (RBC) lysis and peripheral blood mononuclear cell (PBMC) isolation. RESULTS: The residual globin mRNA in leukocytes from RBC lysis (1.00% plus-or-minus sign 1.23%) and PBMC isolation (0.06% plus-or-minus sign 0.03%) was much less than that in leukocytes from BC extraction (17.48% plus-or-minus sign 6.95%) and WB (24.46% plus-or-minus sign 6.43%), resulting in higher transcriptome mapping rates and larger numbers of detected genes. The expression of 616 genes associated with leukocyte function was slightly higher in leukocytes from RBC lysis than that from BC extraction and WB, but barely detected in leukocytes from PBMC isolation. CONCLUSIONS: We suggest that sample processing based on RBC lysis could allow better applications of gene expression profiling of peripheral leukocytes in large cohort studies.

Preterm birth is not only one of the most common causes of infant deaths but also a great risk for them to have severe subsequent health problems. The causes of preterm birth may be due to a combination of genetic and environmental factors, however, it remains largely unknown. Here we report an untargeted lipidomics dataset of plasma specimens from 258 pregnant women at the stage of twelve to twenty-five gestational weeks. Among them, 44 had extremely to very preterm births, 54 had moderate preterm births, 71 had late preterm births and 89 had full-term deliveries. The metabolomic profiling was generated with an UPLC-MS in both the positive and negative mode, and putative identification of all the metabolites was provided by searching against online databases. The quality assessment performed on quality control samples showed that the data is reproducible, robust and reliable. Both the raw data files, the raw and processed data matrix were available on MetaboLights, which may be used as a valuable validation dataset for new findings and a test dataset for novel algorithms.

Cell-free DNA (cfDNA) has been widely used in prenatal test and cancer diagnosis nowadays. The cost- and time- effective isolation kits are needed especially in large-scale clinical application. Here, we compared three domestic kits: VAHTS Serum/Plasma Circulating DNA kit (VZ), MagPure Gel Pure DNA mini kit (MG) and Serum/Plasma Circulating DNA Kit (TG), together with QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (QC) and QIAamp DNA Blood Mini Kit (QD) in cfDNA isolation. cfDNA was isolated from the pooled samples with spike-in fragments, qPCR was conducted to quantify the spike-in fragments recovery. The results indicated that all of the five kits could isolate cfDNA with different efficiency. The VZ kit had an efficiency as high as 90 percent, which is comparable to QC kit. The libraries were constructed using the isolated cfDNAs, quantified by Qubit and analyzed by 2100 bioanalyzer. Both showed the libraries were qualified. Finally, cffDNAs were detected by qPCR targeting SRY gene using libraries from pregnant women bearing male fetuses. All five kits could isolate cffDNAs that could be detected by qPCR. Our results provided more choices in wide-scale clinical application of cfDNA-based non-invasive genetic tests.

Abstract Introduction Peripheral blood leukocytes are essential components of the innate and adaptive immune responses. Their transcriptome reflects an individual’s physiological and pathological state, consequently bulk and single-cell RNA sequencing have been used to assess health and disease. As RNA is dynamic and could be affected by ex vivo conditions before RNA stabilization, we have assessed the influence of temporary storage on the transcriptome. Methods We collected peripheral blood from six healthy donors and processed it immediately or stored it either at 4□ or room temperature (RT, 18–22□) for 2h, 6h and 24h. Total cellular RNA was extracted from leukocytes after red blood cells lysis and the transcriptome analyzed using RNA sequencing. Results We identified 152 up-regulated and 12 down-regulated coding genes in samples stored at 4□ for 24h with most of the up-regulated genes related to nucleosome assembly. More coding genes changed expression at RT, with 1218 increased and 1480 decreased. The increased genes were particularly related to mRNA processing and apoptosis, while the decreased genes were associated with neutrophil activation and cytokine production, implying a reduced proportion of neutrophils, which was confirmed by leukocyte subsets analysis. Most house-keeping genes changed expression during storage, but genes such as TUBB and C1orf43 were relatively stable and could serve as reference genes. Conclusion Temporary storage conditions profoundly affect leukocyte gene expression profiles and change leukocyte subset proportions. Blood samples stored at 4□ for 6h largely maintain their original transcriptome.

Abstract BACKGROUND Plasma cell-free RNA (cfRNA) are potential biomarkers for disease prediction and diagnosis. However, pre-analysis factors, such as the delay in blood processing and storage may lead to unreliable results, though no study has systematically evaluated the effect of blood storage conditions on the whole transcriptome of plasma cfRNA yet. METHODS We collected peripheral blood samples from four healthy subjects and allowed them to stand at room temperature or 4◻ for different time periods (0h, 2h, 6h and 24h) prior to plasma separation. Then, plasma cfRNA stability was evaluated by measuring expression changes of cell-free mRNA, lncRNA and miRNA using high throughput sequencing-based profiling. Finally, their paired leukocyte RNA data were integrated to depict the effect of leukocytes on plasma cfRNA during storage. RESULTS Plasma mRNA and lncRNA presented high correlations (Pearson R 2 ≥ 0.8) and fewer variations when blood was stored at 4◻ for 6 hours or stored at RT for 2 hours. miRNA was more stable, with minimal R 2 of 0.86 at 4◻ for at least 24 hours or at RT for 6 hours. Correlations of plasma RNA and leukocyte RNA increased with the incubation time, and the relative proportion of neutrophils in plasma grown from 14.3% to 61.2% at RT ( P = 0.004), indicating leukocyte RNA contamination. Besides, the tissue enriched genes in plasma were down-regulated with the extension of storage time. CONCLUSIONS Our results characterized the effects of short-term storage of blood samples on plasma cfRNA, which will facilitate further researches or clinical applications to avoid bias resulting from sample processing.