ABSTRACT DNA damage response pathways rely extensively on nuclease activity to process DNA intermediates. Exonuclease 1 (EXO1) is a pleiotropic evolutionary conserved DNA exonuclease involved in various DNA repair pathways, replication, antibody diversification, and meiosis. But, whether EXO1 facilitates these DNA metabolic processes through its enzymatic or scaffolding functions remains unclear. Here we dissect the contribution of EXO1 enzymatic versus scaffolding activity by comparing Exo1 DA/DA mice expressing a proven nuclease-dead mutant form of EXO1 to entirely EXO1-deficient Exo1 −/− and EXO1 wild type Exo1 +/+ mice. We show that Exo1 DA/DA and Exo1 −/− mice are compromised in canonical DNA repair processing, suggesting that the EXO1 enzymatic role is important for error-free DNA mismatch and double-strand break repair pathways. However, in non-canonical repair pathways, EXO1 appears to have a more nuanced function. Next-generation sequencing of heavy chain V region in B cells showed the mutation spectra of Exo1 DA/DA mice to be intermediate between Exo1 +/+ and Exo1 −/− mice, suggesting that both catalytic and scaffolding roles of EXO1 are important for somatic hypermutation. Similarly, while overall class switch recombination in Exo1 DA/DA and Exo1 −/− mice was comparably defective, switch-switch junction analysis suggests that EXO1 might fulfill an additional scaffolding function downstream of class switching. In contrast to Exo1 −/− mice that are infertile, meiosis progressed normally in Exo1 DA/DA and Exo1 +/+ cohorts, indicating that a structural but not the nuclease function of EXO1 is critical for meiosis. However, both Exo1 DA/DA and Exo1 −/− mice displayed similar mortality and cancer predisposition profiles. Taken together, these data demonstrate that EXO1 has both scaffolding and enzymatic functions in distinct DNA repair processes and suggest a more composite and intricate role for EXO1 in DNA metabolic processes and disease.

Abstract Activation-induced cytidine deaminase (AID) somatically hypermutates the immunoglobulin heavy chain variable region (IGHV) gene to create the antibody diversity required to resist infections. This hypermutational process involves many pathways including transcription, DNA structural change and repair. While many of the proteins involved have been identified, their relative abundance, organization and regulation have not been resolved and additional factors and pathways need to be identified. To identify the proteome occupying IGHV, we have utilized dCas9-APEX targeted by guide RNAs to biotinylate and enrich the proteins associated with the mutating V region chromatin in the Ramos human B cell line and compared them to the non-mutating downstream constant region (C) chromatin. We identified hundreds of proteins specifically enriched on the V or C region. We confirmed the functionality of selected factors by examining the changes in the V region-specific proteome after inhibiting transcriptional elongation and somatic mutation with the Dot1L inhibitor EPZ004777. Summary Locus-specific proteomics using dCas9-APEX identifies new aspects of the chromatin context involved in V region somatic hypermutation (SHM) in the human Ramos B cell line. An inhibitor of Dot1L which participates in SHM is used to identify functional SHM-related factors.

Exonucleolytic resection, critical to repair double-strand breaks (DSBs) by recombination, is not well understood, particularly in mammalian meiosis. Here, we define structures of resected DSBs in mouse spermatocytes genome-wide at nucleotide resolution. Resection tracts averaged 1100 nucleotides, but with substantial fine-scale heterogeneity at individual hotspots. Surprisingly, EXO1 is not the major 5′→3′ exonuclease, but the DSB-responsive kinase ATM proved a key regulator of both initiation and extension of resection. In wild type, apparent intermolecular recombination intermediates clustered near to but offset from DSB positions, consistent with joint molecules with incompletely invaded 3′ ends. Finally, we provide evidence for PRDM9-dependent chromatin remodeling leading to increased accessibility at recombination sites. Our findings give insight into the mechanisms of DSB processing and repair in meiotic chromatin.

During meiosis, induction of DNA double strand breaks (DSB) leads to recombination between homologous chromosomes, resulting in crossovers (CO) and non-crossovers (NCO). Only 10% DSBs resolve as COs, mostly through a class I pathway dependent on MutS (MSH4/MSH5). Class II CO events represent a minor proportion of the total CO count and also arise from DSBs, but are not thought to involve MutS. However, loading of MutS occurs very early in prophase I at a frequency that far exceeds the final number of class I COs found in late prophase I. Moreover, loss of MutS in mouse results in apoptosis before CO formation, preventing analysis of its CO function. We generated a mutation in the ATP binding domain of Msh5 (Msh5GA). While this mutation was not expected to affect MutS complex formation, MutS foci do not accumulate during prophase I. Nevertheless, while some spermatocytes from Msh5-/- animals progress into pachynema, most spermatocytes from Msh5GA/GA mice progress to late pachynema and beyond. Some spermatocytes from Msh5GA/GA mice complete prophase I entirely, allowing for the first time an assessment of MSH5 function in CO formation. At pachynema, Msh5GA/GA spermatocytes show persistent DSBs, incomplete homolog pairing, and fail to accumulate MutL (MLH1/MLH3). Unexpectedly, Msh5GA/GA diakinesis-staged spermatocytes have no chiasmata at all from any CO pathway, indicating that a functional MutS complex in early prophase I is a pre-requisite for all COs.

Abstract The Huntington’s disease mutation is a CAG repeat expansion in the huntingtin gene that results in an expanded polyglutamine tract in the huntingtin protein. The CAG repeat is unstable, and expansions of hundreds of CAGs have been detected in Huntington’s disease post-mortem brains. The age of disease onset can be predicted partially from the length of the CAG repeat as measured in blood. Onset age is also determined by genetic modifiers, which in six cases involve variation in DNA mismatch repair pathways genes. Knocking-out specific mismatch repair genes in mouse models of Huntington’s disease prevents somatic CAG repeat expansion. Taken together, these results have led to the hypothesis that somatic CAG repeat expansion in Huntington’s disease brains is required for pathogenesis. Therefore, the pathogenic repeat threshold in brain is longer than (CAG) 40 , as measured in blood, and is currently unknown. The mismatch repair gene MSH3 has become a major focus for therapeutic development, as unlike other mismatch repair genes, nullizygosity for MSH3 does not cause malignancies associated with mismatch repair deficiency. Potential treatments targeting MSH3 currently under development include gene therapy, biologics and small molecules, which will be assessed for efficacy in mouse models of Huntington’s disease. The zQ175 knock-in model carries a mutation of approximately (CAG) 185 and develops early molecular and pathological phenotypes that have been extensively characterised. Therefore, we crossed the mutant huntingtin allele onto heterozygous and homozygous Msh3 knock-out backgrounds to determine the maximum benefit of targeting Msh3 in this model. Ablation of Msh3 prevented somatic expansion throughout the brain and periphery, and reduction of Msh3 by 50% decreased the rate of expansion. This had no effect on the deposition of huntingtin aggregation in the nuclei of striatal neurons, nor on the dysregulated striatal transcriptional profile. This contrasts with ablating Msh3 in knock-in models with shorter CAG repeat expansions. Therefore, further expansion of a (CAG) 185 repeat in striatal neurons does not accelerate the onset of molecular and neuropathological phenotypes. It is striking that highly expanded CAG repeats of a similar size in humans cause disease onset before 2 years of age, indicating that somatic CAG repeat expansion in the brain is not required for pathogenesis. Given that the trajectory for somatic CAG expansion in the brains of Huntington’s disease mutation carriers is unknown, our study underlines the importance of administering treatments targeting somatic instability as early as possible.