Hyperactivation of the PI3K signaling is common in human cancers, including gliomas, but the precise role of the pathway in glioma biology remains to be determined. Some limited understanding of PI3K signaling in brain cancer come from studies on neural stem/progenitor cells (NSPCs) where signals transmitted via the PI3K pathway cooperate with other intracellular pathways and downstream transcription factors to regulate NSPC proliferation. To investigate the role for the PI3K pathway in glioma initiation and development, we generated a mouse model targeting the inducible expression of a Pik3ca H1047A oncogenic mutation and simultaneous deletion of the PI3K negative regulator, Pten, in NSPCs. We show that the expression of a Pik3ca H1047A was sufficient to initiate tumorigenesis but that simultaneous loss of Pten, was required for the development of invasive, high-grade glioma. Mutant NSPCs exhibited enhanced neurosphere forming capacity which correlated with increased Wnt signaling. We also show that loss of CREB in Pik3ca-PTEN tumors led to a longer symptom-free survival in mice. Taken together, our findings present a novel mouse model for high-grade glioma with which we demonstrate that the PI3K pathway is important for initiation of tumorigenesis and that disruption of downstream CREB signaling attenuates tumor expansion.

Limitations in discovering useful tumor biomarkers and drug targets is not only due to patient-to-patient differences but also due to intratumoral heterogeneity. Heterogeneity arises due to the genetic and epigenetic variation of tumor cells in response to microenvironmental interactions and cytotoxic therapy. We explored specific signaling pathway activation in glioblastoma (GBM) by investigating the intratumoral activation of the MAPK and PI3K pathways. We present data demonstrating a striking preponderance for mutual exclusivity of MAPK and PI3K activation in GBM tissue, where MAPK activation correlates with proliferation and transcription factor CREB activation and PI3K activation correlates with CD44 expression. Bioinformatic analysis of signaling and CREB-regulated target genes supports the immunohistochemical data, showing that the MAPK-CREB activation correlates with proliferative regions. In-silico analysis suggests that MAPK-CREB signaling activates a pro-inflammatory molecular signature and correlates with a mesenchymal GBM subtype profile, while PI3K-CREB activation correlates with the proneural GBM subtype and a tumor cell invasive gene signature. Overall, the data suggests the existence of intratumoral subtype heterogeneity in GBM and that using combinations of both MAPK and PI3K drug inhibitors is necessary for effective targeted therapy.

Abstract BACKGROUND Pediatric high-grade gliomas (pHGGs) pose a significant challenge as the most aggressive central nervous system tumors in children. The lack of effective treatment and poor survival rates emphasize the critical need for innovative therapies to improve the prognosis of pediatric patients with pHGG. METHODS We executed CRISPR-cas9 knockout (KO) screenings in 65 pediatric and 10 adult high-grade glioma (HGG) cell lines to explore unique functional dependencies associated with pHGGs. Drug assays were carried out to assess the targetability of a gene dependency of interest in pHGG cell lines. Subsequently, Random Forest machine learning algorithm was employed on ‘omics’ datasets to identify biomarkers indicative of drug response. Finally, biomarkers were confirmed through sequencing-based methods across various pediatric cancers. RESULTS CRISPR-cas9 KO screens revealed 8 crucial genes essential for pHGG growth, namely MCL-1, ATIC, DHFR, EED, HDAC2, PARP1, PDK1, PIK3CA and TYMS. Among these, Myeloid Cell Leukemia (MCL-1) was further characterized as it emerged as the top differential genetic dependency in pHGGs. Consistent with this, MCL1 inhibitors exhibited potent anti-cancer activity on 43% of pHGG cell lines. Multi-feature prediction analysis identified 140 features correlated to response. Strikingly, a previously undescribed methylation site within the BCL2L1 locus, cg00300298, ranked in the top 5% of features. Tissue analysis revealed a wide range of other pediatric brain cancers that harbor the BCL2L1 cg00300298 methylation mark as compared to non-malignant brain tissue. Lastly, we validated the utility of BCL2L1 methylation as a predictive biomarker of MCL1 inhibitor sensitivity across a large panel of pediatric brain cancer cell lines. CONCLUSION Using an integrated genomic approach, we identify MCL1 as a distinct therapeutic target in BCL2L1-methylated pediatric brain cancers. This offers a rational approach for stratifying patients who may benefit from MCL1 inhibitors.

Abstract BACKGROUND Pediatric high-grade gliomas (HGGs) present a therapeutic challenge due to their aggressive behavior and limited treatment options. Traditional treatments often fall short in addressing the genetic complexity and aggressiveness of pediatric HGGs, urging the search for and validation of novel genetic dependencies as potential therapeutic targets. METHODS Loss of function CRISPR screens enable the systematic investigation of gene function by selectively disrupting gene expression, offering invaluable insights into the genetic dependencies fuelling tumor growth and survival. Herein, we conducted genome-scale, loss of function CRISPR/Cas12 screens across genetically-defined subtypes of pediatric HGG, including diffuse midline gliomas (n=30 cell lines). RESULTS Distinct genetic dependencies exclusive to pediatric high-grade gliomas (pHGG) are uncovered compared to their adult counterparts, particularly within druggable pathways. These dependencies are associated with specific pathways such as cellular metabolism, epigenetics, and tissue development. Notably, histone-altered subtypes of pHGG exhibit dependency on distinct gene sets for growth. Furthermore, machine learning techniques are applied to correlate various -omics features (RNA, DNA, epigenomics, proteomics) with genetic dependencies, facilitating the identification of biomarkers predictive of therapeutic response. CONCLUSION Our work provides a comprehensive genetic dependency map of pHGG. We expect this data to serve as a springboard for enriching our biological understanding of pHGG, ultimately improving clinical outcomes and quality of life.

Diffuse midline glioma (DMG), including tumors diagnosed in the brainstem (diffuse intrinsic pontine glioma DIPG), are uniformly fatal brain tumors that lack effective pharmacological treatment. Analysis of pooled CRISPR-Cas9 loss-of-function gene deletion screen datasets, identified PIK3CA and MTOR as targetable molecular dependencies across DIPG patient derived models, highlighting the therapeutic potential of the blood-brain barrier penetrant PI3K/Akt/mTOR inhibitor paxalisib. At the human equivalent maximum tolerated dose, mice treated with paxalisib experienced systemic feedback resulting in increased blood glucose and insulin levels, commensurate with DIPG patients in Phase 1b clinical trials who experienced hyperglycemia/hyperinsulinemia. To exploit genetic dependences, but maintain compliance and benefit, we optimized a paxalisib treatment regimen that employed reduced dosing more frequently, in combination with the anti-hyperglycemic drug, metformin. Combining optimized dosing with metformin restored glucose homeostasis and decreased phosphorylation of the insulin receptor in vivo, a common mechanism of PI3K-inhibitor resistance, extending the survival of DIPG xenograft models. RNA sequencing and phosphoproteomic profiling of DIPG models treated with paxalisib identified increased calcium-activated PKC signaling. Using the brain penetrant PKC inhibitor, enzastaurin in combination with paxalisib, we synergistically extended the survival of orthotopic xenograft models, benefits further promoted by metformin; thus, identifying a clinically relevant DIPG combinatorial approach.