The hydroxamic acid (HAA) analogue pan-histone deacetylase (HDAC) inhibitors (HDIs) LAQ824 and LBH589 have been shown to induce acetylation and inhibit the ATP binding and chaperone function of heat shock protein (HSP) 90. This promotes the polyubiquitylation and degradation of the pro-growth and pro-survival client proteins Bcr-Abl, mutant FLT-3, c-Raf, and AKT in human leukemia cells. HDAC6 is a member of the class IIB HDACs. It is predominantly cytosolic, microtubule-associated α-tubulin deacetylase that is also known to promote aggresome inclusion of the misfolded polyubiquitylated proteins. Here we demonstrate that in the Bcr-abl oncogene expressing human leukemia K562 cells, HDAC6 can be co-immunoprecipitated with HSP90, and the knock-down of HDAC6 by its siRNA induced the acetylation of HSP90 and α-tubulin. Depletion of HDAC6 levels also inhibited the binding of HSP90 to ATP, reduced the chaperone association of HSP90 with its client proteins, e.g. Bcr-Abl, and induced polyubiquitylation and partial depletion of Bcr-Abl. Conversely, the ectopic overexpression of HDAC6 inhibited LAQ824-induced acetylation of HSP90 and α-tubulin and reduced LAQ824-mediated depletion of Bcr-Abl, AKT, and c-Raf. Collectively, these findings indicate that HDAC6 is also an HSP90 deacetylase. Targeted inhibition of HDAC6 leads to acetylation of HSP90 and disruption of its chaperone function, resulting in polyubiquitylation and depletion of pro-growth and pro-survival HSP90 client proteins including Bcr-Abl. Depletion of HDAC6 sensitized human leukemia cells to HAA-HDIs and proteasome inhibitors. The hydroxamic acid (HAA) analogue pan-histone deacetylase (HDAC) inhibitors (HDIs) LAQ824 and LBH589 have been shown to induce acetylation and inhibit the ATP binding and chaperone function of heat shock protein (HSP) 90. This promotes the polyubiquitylation and degradation of the pro-growth and pro-survival client proteins Bcr-Abl, mutant FLT-3, c-Raf, and AKT in human leukemia cells. HDAC6 is a member of the class IIB HDACs. It is predominantly cytosolic, microtubule-associated α-tubulin deacetylase that is also known to promote aggresome inclusion of the misfolded polyubiquitylated proteins. Here we demonstrate that in the Bcr-abl oncogene expressing human leukemia K562 cells, HDAC6 can be co-immunoprecipitated with HSP90, and the knock-down of HDAC6 by its siRNA induced the acetylation of HSP90 and α-tubulin. Depletion of HDAC6 levels also inhibited the binding of HSP90 to ATP, reduced the chaperone association of HSP90 with its client proteins, e.g. Bcr-Abl, and induced polyubiquitylation and partial depletion of Bcr-Abl. Conversely, the ectopic overexpression of HDAC6 inhibited LAQ824-induced acetylation of HSP90 and α-tubulin and reduced LAQ824-mediated depletion of Bcr-Abl, AKT, and c-Raf. Collectively, these findings indicate that HDAC6 is also an HSP90 deacetylase. Targeted inhibition of HDAC6 leads to acetylation of HSP90 and disruption of its chaperone function, resulting in polyubiquitylation and depletion of pro-growth and pro-survival HSP90 client proteins including Bcr-Abl. Depletion of HDAC6 sensitized human leukemia cells to HAA-HDIs and proteasome inhibitors. Several reports have emphasized that heat shock protein (HSP) 1The abbreviations used are: HSP, heat shock protein; 17-AAG, 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin; HAT, histone acetyltransferase; HDAC, histone deacetylase; HAA, hydroxamic acid; HDI, HDAC inhibitor; PMSF, phenylmethylsulfonyl fluoride; siRNA, small interfering RNA; TDAC, α-tubulin deacetylase; ITD, internal tandem duplication; CML, chronic myeloid leukemia; AML, acute myeloid leukemia. 1The abbreviations used are: HSP, heat shock protein; 17-AAG, 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin; HAT, histone acetyltransferase; HDAC, histone deacetylase; HAA, hydroxamic acid; HDI, HDAC inhibitor; PMSF, phenylmethylsulfonyl fluoride; siRNA, small interfering RNA; TDAC, α-tubulin deacetylase; ITD, internal tandem duplication; CML, chronic myeloid leukemia; AML, acute myeloid leukemia.90 serves as the chaperone protein required for the proper folding and maintenance of a number of signaling protein kinases, e.g. the wild type or mutant Bcr-Abl, mutant FLT-3, AKT, and c-Raf, in their native, mature, stable, and functionally active conformations (1Hartl F.U. Hayer-Hartl M. Science. 2002; 295: 1852-1858Crossref PubMed Scopus (2767) Google Scholar, 2Picard D. Cell. Mol. Life Sci. 2002; 59: 1640-1648Crossref PubMed Scopus (652) Google Scholar, 3Isaacs J.S. Xu W. Neckers L. Cancer Cell. 2003; 3: 213-217Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (538) Google Scholar, 4Nimmanapalli R. O'Bryan E. Bhalla K. Cancer Res. 2001; 61: 1799-1804PubMed Google Scholar, 5George P. Bali P. Cohen P. Tao J. Guo F. Sigua C. Vishvanath A. Li Y. Moscinski L. Bhalla K. Cancer Res. 2004; 64: 3645-3652Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar, 6Bagatell R. Whitesell L. Mol. Cancer Ther. 2004; 3: 1021-1030Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar); this is achieved by HSP90 through ATP binding and hydrolysis (7Grenert J.P. Sullivan W.P. Fadden P. Haystead T. Clark J. Mimnaugh E. Krutzsch H. Ochel H.J. Schulte T.W. Sausville E. Nechers L.M. Toft D.O. J. Biol. Chem. 1997; 272: 23843-23850Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (506) Google Scholar, 8Wegele H. Muschler P. Bunck M. Reinstein J. Buchner J. J. Biol. Chem. 2003; 278: 39303-39310Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (56) Google Scholar). ATP/ADP binding to the hydrophobic N-terminal pocket alters HSP90 conformation, resulting in the interaction of HSP90 with a co-chaperone complex that protects or stabilizes the client proteins or with an alternative subset of co-chaperones that directs the misfolded client proteins to a covalent linkage with polyubiquitin and subsequent degradation by the 26 S proteasome (7Grenert J.P. Sullivan W.P. Fadden P. Haystead T. Clark J. Mimnaugh E. Krutzsch H. Ochel H.J. Schulte T.W. Sausville E. Nechers L.M. Toft D.O. J. Biol. Chem. 1997; 272: 23843-23850Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (506) Google Scholar, 8Wegele H. Muschler P. Bunck M. Reinstein J. Buchner J. J. Biol. Chem. 2003; 278: 39303-39310Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (56) Google Scholar, 9Pratt W.B. Toft D.O. Exp. Biol. Med. 2003; 228: 111-133Crossref PubMed Scopus (1249) Google Scholar). Benzoquinone ansamycin antibiotic geldanamycin and its less toxic analogue 17-AAG bind to the ATP/ADP binding pocket, replacing the nucleotide and inhibiting the chaperone function of HSP90 (3Isaacs J.S. Xu W. Neckers L. Cancer Cell. 2003; 3: 213-217Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (538) Google Scholar, 6Bagatell R. Whitesell L. Mol. Cancer Ther. 2004; 3: 1021-1030Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar, 10Stebbins C.E. Russo A.A. Schneider C. Rosen N. Hartl F.U. Pavletich N.P. Cell. 1997; 89: 239-250Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1234) Google Scholar). By blocking ATP binding to HSP90, treatment with 17-AAG stabilizes HSP90 conformation into the alternative one that recruits HSP70-based co-chaperone complex, which binds the misfolded client proteins and directs them to polyubiquitylation and proteasomal degradation (11Meyer P. Prodromou C. Hu B. Vaughan C. Roe S.M. Panaretou B. Piper P.W. Pearl L.H. Mol. Cell. 2003; 11: 647-658Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (367) Google Scholar).Histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs) are enzymes that catalyze the acetylation and deacetylation, respectively, of the N termini of the core nucleosomal histone tails at evolutionarily conserved lysine residues (12Felsenfeld G. Groudine M. Nature. 2003; 421: 448-453Crossref PubMed Scopus (804) Google Scholar, 13Khorasanizadeh S. Cell. 2004; 116: 259-272Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (511) Google Scholar, 14Schreiber S.L. Bernstein B.E. Cell. 2002; 111: 771-778Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (326) Google Scholar). Following recruitment by multiprotein transcriptional complexes to the promoters of genes, the balance between the activities of HATs and HDACs regulates the acetylation status of chromatin and transcription through chromatin modification without directly binding the DNA (15Cress W.D. Seto E. J. Cell. Physiol. 2000; 184: 1-16Crossref PubMed Scopus (575) Google Scholar). Importantly, these enzymes also affect the acetylation status of specific lysine residues of a number of transcription factors, which may affect their DNA binding and transcriptional activity (16Marks P.A. Rifkind R.A. Richon V.M. Breslow R. Miller T. Kelly W.K. Nat. Rev. Cancer. 2001; 1: 194-202Crossref PubMed Scopus (1680) Google Scholar, 17Johnstone R.W. Licht J.D. Cancer Cell. 2003; 4: 13-18Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (436) Google Scholar). Three classes of HDACs have been identified: classes I, II (A and B), and III (16Marks P.A. Rifkind R.A. Richon V.M. Breslow R. Miller T. Kelly W.K. Nat. Rev. Cancer. 2001; 1: 194-202Crossref PubMed Scopus (1680) Google Scholar, 17Johnstone R.W. Licht J.D. Cancer Cell. 2003; 4: 13-18Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (436) Google Scholar). Treatment with the novel hydroxamic acid analogue (HAA) pan-HDAC inhibitors (HDIs) LAQ824 and LBH589 not only has been shown to induce acetylation of histones, induction of p21, cell cycle growth arrest, and apoptosis but also has been demonstrated to induce acetylation of HSP90 (18Nimmanapalli R. Fuino L. Bali P. Gasparetto M. Glozak M. Tao J. Moscinski L. Smith C. Wu J. Jove R. Atadja P. Bhalla K. Cancer Res. 2003; 63: 5126-5135PubMed Google Scholar, 19Fuino L. Bali P. Wittmann S. Donapaty S. Guo F. Yamaguchi H. Wang H.-G. Atadja P. Bhalla K. Mol. Cancer Ther. 2003; 2: 971-984PubMed Google Scholar, 20Bali P. George P. Cohen P. Tao J. Guo F. Sigua C. Vishvanath A. Scuto A. Annavarapu S. Fiskus W. Moscinski L. Atadja P. Bhalla K. Clin. Cancer Res. 2004; 10: 4991-4997Crossref PubMed Scopus (118) Google Scholar). This is associated with polyubiquitylation, proteasomal degradation, and depletion of Bcr-Abl, AKT, and c-Raf in CML cells as well as mutant FLT-3 in AML cells (18Nimmanapalli R. Fuino L. Bali P. Gasparetto M. Glozak M. Tao J. Moscinski L. Smith C. Wu J. Jove R. Atadja P. Bhalla K. Cancer Res. 2003; 63: 5126-5135PubMed Google Scholar, 19Fuino L. Bali P. Wittmann S. Donapaty S. Guo F. Yamaguchi H. Wang H.-G. Atadja P. Bhalla K. Mol. Cancer Ther. 2003; 2: 971-984PubMed Google Scholar, 20Bali P. George P. Cohen P. Tao J. Guo F. Sigua C. Vishvanath A. Scuto A. Annavarapu S. Fiskus W. Moscinski L. Atadja P. Bhalla K. Clin. Cancer Res. 2004; 10: 4991-4997Crossref PubMed Scopus (118) Google Scholar). These observations raised the issue as to which of the HDACs is responsible for deacetylating HSP90, such that its inhibition by HAA-HDIs induces acetylation and undermines the chaperone function of HSP90. HDAC6 is predominantly a cytoplasmic, microtubule-associated member of the class IIB family of HDACs (21Verdin E. Dequiedt F. Kasler H.G. Trends Genet. 2003; 19: 286-293Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (544) Google Scholar). HDAC6 is unique in possessing two catalytic domains and a C-terminal zinc finger domain that binds both polyubiquitylated misfolded proteins and the dynein motor (22Hook S.S. Orian A. Cowley S.M. Eisenman R.N. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 99: 13425-13430Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar, 23Kawaguchi Y. Kovacs J.J. McLaurin A. Vance J.M. Ito A. Yao T.P. Cell. 2003; 115: 727-738Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1176) Google Scholar). The C-terminal catalytic domain of HDAC6 possesses α-tubulin deacetylase activity, which is inhibited by the small molecule inhibitor tubacin (24Hubbert C. Guardiola A. Shao R. Kawaguchi Y. Ito A. Nixon A. Yoshida M. Wang X.F. Yao T.P. Nature. 2002; 417: 455-458Crossref PubMed Scopus (1746) Google Scholar, 25Zhang Y. Li N. Caron C. Matthias G. Hess D. Khochbin S. Matthias P. EMBO J. 2003; 22: 1168-1179Crossref PubMed Scopus (563) Google Scholar, 26Matsuyama A. Shimazu T. Sumida Y. Saito A. Yoshimatsu Y. Seigneurin-Berny D. Osada H. Komatsu Y. Nishino N. Khochbin S. Horinouchi S. Yoshida M. EMBO J. 2002; 21: 6820-6831Crossref PubMed Scopus (569) Google Scholar, 27Haggarty S.J. Koeller K.M. Wong J.C. Grozinger C.M. Schreiber S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003; 100: 4389-4394Crossref PubMed Scopus (887) Google Scholar). HDAC6 has also been demonstrated to direct the polyubiquitylated misfolded proteins into aggresomes, thus regulating the cellular management of the misfolded protein stress response (23Kawaguchi Y. Kovacs J.J. McLaurin A. Vance J.M. Ito A. Yao T.P. Cell. 2003; 115: 727-738Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1176) Google Scholar). Collectively, these features of HDAC6 suggested that HDAC6 might be involved in HSP90 deacetylation. In the present studies we determined whether HDAC6 regulates the acetylation status of HSP90 and whether depletion or inhibition of HDAC6 affects the chaperone function of HSP90 in human leukemia cells.EXPERIMENTAL PROCEDURESReagents and Antibodies—17-AAG was obtained from Developmental Therapeutics Branch of CTEP, NCI, National Institutes of Health (Bethesda, MD). LBH589 and LAQ824 were provided by Novartis Pharmaceuticals Inc. (East Hanover, NJ). ATP-Binders resin was purchased from EMD Biosciences (San Diego, CA). Anti-HSP90 and -HSP70 antibodies were purchased from StressGen Biotechnologies Corp. (Victoria, British Columbia, Canada). Monoclonal anti-acetyl lysine and polyclonal anti-HDAC3 antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Monoclonal anti-acetyl α-tubulin and anti-FLAG (M2) antibody were purchased from Sigma-Aldrich. Monoclonal anti-Abl and HDAC1 and polyclonal anti-HDAC2 and HDAC6 were purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Polyclonal HDAC10 antibody was purchased from Biovision Inc. (Mountain View, CA).Cell Culture—Human CML K562 (expressing Bcr-Abl), acute myeloid leukemia HL-60 and acute leukemia MV4-11 (containing a 30-base pair-long ITD in exon 14 of FLT-3) cells were obtained from American Type Culture Collection (Manassas, VA) and maintained in culture in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum. The cells were passaged twice a week as described previously (19Fuino L. Bali P. Wittmann S. Donapaty S. Guo F. Yamaguchi H. Wang H.-G. Atadja P. Bhalla K. Mol. Cancer Ther. 2003; 2: 971-984PubMed Google Scholar, 28Nimmanapalli R. O'Bryan E. Huang M. Bali P. Burnette P.K. Loughran T. Tepperberg J. Jove R. Bhalla K. Cancer Res. 2002; 62: 5761-5769PubMed Google Scholar). Logarithmically growing cells were exposed to the designated concentrations and exposure intervals of the drugs. Following these treatments, cells were pelleted and washed free of the drug(s) prior to performance of the studies described below.Western blot Analyses—Western analyses of Bcr-Abl, c-Raf-1, AKT, p21, HDAC1, -2, -3, -6, and -10 proteins and β-actin were performed using specific antisera or monoclonal antibodies (see above) as described previously (19Fuino L. Bali P. Wittmann S. Donapaty S. Guo F. Yamaguchi H. Wang H.-G. Atadja P. Bhalla K. Mol. Cancer Ther. 2003; 2: 971-984PubMed Google Scholar, 28Nimmanapalli R. O'Bryan E. Huang M. Bali P. Burnette P.K. Loughran T. Tepperberg J. Jove R. Bhalla K. Cancer Res. 2002; 62: 5761-5769PubMed Google Scholar, 29Fang G. Kim C.N. Perkins C.L. Ramadevi N. Winton E. Wittmann S. Bhalla K.N. Blood. 2000; 96: 2246-2256Crossref PubMed Google Scholar). Horizontal scanning densitometry was performed on Western blots using acquisition into Adobe PhotoShop (Adobe Systems Inc., San Jose, CA) and analysis by the NIH Image program (National Institutes of Health, Bethesda, MD). The expression of β-actin was used as a loading control.Acetylation of HSP90 and Its Binding to ATP-Sepharose—Untreated or LAQ824-treated cells were lysed in TNESV buffer (50 mm Tris, 2 mm EDTA, 100 nm NaCl, 1 mm sodium orthovanadate, 25 mm NaF, and 1% Triton X-100, pH 7.5), and total cellular proteins were quantified using the BCA protein assay. HSP90 was immunoprecipitated from 200 μg of total protein using mouse HSP90 antibody, and immunoprecipitates were immunoblotted with anti-acetyl lysine antibody as described previously (18Nimmanapalli R. Fuino L. Bali P. Gasparetto M. Glozak M. Tao J. Moscinski L. Smith C. Wu J. Jove R. Atadja P. Bhalla K. Cancer Res. 2003; 63: 5126-5135PubMed Google Scholar, 19Fuino L. Bali P. Wittmann S. Donapaty S. Guo F. Yamaguchi H. Wang H.-G. Atadja P. Bhalla K. Mol. Cancer Ther. 2003; 2: 971-984PubMed Google Scholar, 30Yu X. Guo Z.S. Marcu M.G. Neckers L. Nguyen D.M. Chen G.A. Schrump D.S. J. Natl. Cancer Inst. 2002; 94: 504-513Crossref PubMed Scopus (358) Google Scholar). Alternatively, cell lysates were prepared after drug treatment, and HSP90 was affinity-precipitated from 200 μg of total cellular protein using ATP-Sepharose beads. The concentration of HSP90 in the precipitates was assessed by Western blot analysis using a monoclonal anti-HSP90 antibody (18Nimmanapalli R. Fuino L. Bali P. Gasparetto M. Glozak M. Tao J. Moscinski L. Smith C. Wu J. Jove R. Atadja P. Bhalla K. Cancer Res. 2003; 63: 5126-5135PubMed Google Scholar, 19Fuino L. Bali P. Wittmann S. Donapaty S. Guo F. Yamaguchi H. Wang H.-G. Atadja P. Bhalla K. Mol. Cancer Ther. 2003; 2: 971-984PubMed Google Scholar, 30Yu X. Guo Z.S. Marcu M.G. Neckers L. Nguyen D.M. Chen G.A. Schrump D.S. J. Natl. Cancer Inst. 2002; 94: 504-513Crossref PubMed Scopus (358) Google Scholar).Assessment of Percentage of Nonviable Cells—Cells were stained with trypan blue (Sigma). The numbers of nonviable cells were determined by counting the cells that showed trypan blue uptake in a hemocytometer and reported as percentage of untreated control cells (5George P. Bali P. Cohen P. Tao J. Guo F. Sigua C. Vishvanath A. Li Y. Moscinski L. Bhalla K. Cancer Res. 2004; 64: 3645-3652Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar, 20Bali P. George P. Cohen P. Tao J. Guo F. Sigua C. Vishvanath A. Scuto A. Annavarapu S. Fiskus W. Moscinski L. Atadja P. Bhalla K. Clin. Cancer Res. 2004; 10: 4991-4997Crossref PubMed Scopus (118) Google Scholar).Immunoprecipitation of HSP90 or Bcr-Abl and Immunoblot Analyses—Following the designated treatments, cells were lysed in lysis buffer (20 mm Tris, pH 8, 150 nm sodium chloride, 1% Triton X-100, 0.1 m NaF, 1 mm PMSF, 1 mm sodium orthovanadate, 2.5 μg/ml leupeptin, 5 μg/ml aprotinin) for 30 min on ice, and the nuclear and cellular debris were cleared by centrifugation. Cell lysates (200 μg) were incubated with HSP90 or Abl-specific monoclonal antibody for 1 h at 4 °C. To this mixture, washed protein G-agarose beads were added and incubated overnight at 4 °C. The immunoprecipitates were washed three times in the lysis buffer, and proteins were eluted with the SDS sample loading buffer prior to immunoblot analyses with specific antibodies against HSP90, anti-Abl, HDAC6, anti-acetyl lysine or anti-ubiquitin antibody (18Nimmanapalli R. Fuino L. Bali P. Gasparetto M. Glozak M. Tao J. Moscinski L. Smith C. Wu J. Jove R. Atadja P. Bhalla K. Cancer Res. 2003; 63: 5126-5135PubMed Google Scholar, 31Guo F. Sigua C. Tao J. Bali P. George P. Li Y. Wittmann S. Moscinski L. Atadja P. Bhalla K. Cancer Res. 2004; 64: 2580-2589Crossref PubMed Scopus (197) Google Scholar).Preparation of Detergent-soluble and Insoluble Fractions—After the designated drug treatments, cells were lysed with TNSEV buffer (50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 2 mm EDTA, 100 mm NaCl, 1 mm sodium orthovanadate, 1% Nonidet P-40 containing 20 μg/ml aprotinin, 20 μg/ml leupeptin, 1 mm PMSF, 25 mm NaF, and 5 mm N-ethylmaleimide) (16Marks P.A. Rifkind R.A. Richon V.M. Breslow R. Miller T. Kelly W.K. Nat. Rev. Cancer. 2001; 1: 194-202Crossref PubMed Scopus (1680) Google Scholar). The insoluble fractions (pellet) were solubilized with SDS buffer (80 mm Tris, pH 6.8, 2% SDS, 100 mm dithiothreitol, and 10% glycerol). Fifty μg of proteins from the Nonidet P-40-soluble and insoluble fractions were separated on 7.5% SDS-polyacrylamide gel and analyzed by Western blotting (18Nimmanapalli R. Fuino L. Bali P. Gasparetto M. Glozak M. Tao J. Moscinski L. Smith C. Wu J. Jove R. Atadja P. Bhalla K. Cancer Res. 2003; 63: 5126-5135PubMed Google Scholar, 19Fuino L. Bali P. Wittmann S. Donapaty S. Guo F. Yamaguchi H. Wang H.-G. Atadja P. Bhalla K. Mol. Cancer Ther. 2003; 2: 971-984PubMed Google Scholar).Ectopic Overexpression of HDAC6—N-terminal FLAG-tagged cDNA of HDAC6 (kindly provided by Dr. Eric Verdin, Gladstone Institute of Virology and Immunology, University of California, San Francisco) was cloned into the pcDNA3.1 plasmid vector (Invitrogen). This and the control vector were transiently transfected into K562 cells by a previously described method (18Nimmanapalli R. Fuino L. Bali P. Gasparetto M. Glozak M. Tao J. Moscinski L. Smith C. Wu J. Jove R. Atadja P. Bhalla K. Cancer Res. 2003; 63: 5126-5135PubMed Google Scholar, 32Zhang X. Ozawa Y. Lee H. Wen Y.-D. Tan T.-H. Wadzinski B.E. Seto E. Genes Dev. 2005; 19: 827-839Crossref PubMed Scopus (180) Google Scholar).Creation and Transfection of HDAC6 siRNA Vector—K562 cells were transiently transfected utilizing an Amaxa Nucleofector Electroporator with the plasmid vector pBS/U6 with or without HDAC6 siRNA (32Zhang X. Ozawa Y. Lee H. Wen Y.-D. Tan T.-H. Wadzinski B.E. Seto E. Genes Dev. 2005; 19: 827-839Crossref PubMed Scopus (180) Google Scholar). This had a 21-nucleotide sequence (5′-GG ATG GAT CTG AAC CTT GAG A-3′) corresponding to the targeted codons 200–219 in the HDAC6 mRNA (GenBank™ accession number BC013737) or a nonspecific siRNA encoding sequence. Forty-eight h following transfection, cell lysates were screened for HDAC6 expression by Western blot analysis. The most efficient knock-down cells with markedly reduced expression of HDAC6 were utilized for further studies.Statistical Analyses—Data were expressed as mean ± S.E. Comparisons used Student's t test or analysis of variance as appropriate. p values of <0.05 were assigned significance.RESULTSWe first determined the effects of LAQ824 and LBH589 treatment on HSP90 acetylation in human leukemia K562, MV4–11, and HL-60 cells. After exposure of cells to LAQ824 for 16 h, immunoprecipitation of HSP90 followed by immunoblotting with an antibody that recognizes anti-acetylated lysine residues was performed. Acetylation of HSP90 in a dose-dependent manner was observed, without significant effect on the levels of HSP90 (Fig. 1A). Exposure to LBH589 exerted a similar effect on HSP90 acetylation (data not shown). In contrast, treatment with sodium butyrate or trapoxin (which are known not to inhibit the activities of class II HDACs) for 16 h did not induce HSP90 acetylation (Fig. 1B). Exposure to tubacin, which inhibits only the α-tubulin deacetylase (TDAC) domain of HDAC6, caused only a minimal increase in HSP90 acetylation. Following treatment of K562 cells with LAQ824 or LBH589 for 16 h, HSP90 was affinity-precipitated from the cell lysates with ATP-Sepharose, and the levels of HSP90 were estimated by immunoblot analysis. LAQ824- and LBH589-mediated acetylation of HSP90 was associated with decreased binding of ATP-Sepharose to HSP90 (Fig. 1C). While 17-AAG, the geldanamycin analogue inhibitor of the ATP binding pocket of HSP90, was also effective in inhibiting the binding of ATP-Sepharose to HSP90, treatment with sodium butyrate, trapoxin, or tubacin (not shown) was ineffective (Fig. 1C).Next, we evaluated the impact of these modifications on the function of HSP90 as a chaperone protein. Following exposure of K562 cells to LAQ824 for 16 h, Bcr-Abl was immunoprecipitated from the cell lysates, and the binding of Bcr-Abl to HSP90 versus HSP70 was determined. Fig. 2A demonstrates that, similar to what has been observed with 17-AAG, treatment with LAQ824 shifted the chaperone association of Bcr-Abl from HSP90 to HSP70. A similar shift in the chaperone association was also seen following treatment with LBH589 (data not shown). Previous reports have shown that the shift in the chaperone association of the client proteins to the HSP70 containing unstable multichaperone complex induces polyubiquitylation and accumulation of the client proteins in the detergent-insoluble cellular fraction. Polyubiquitylation marks the client proteins for degradation by the 26 S proteasome (3Isaacs J.S. Xu W. Neckers L. Cancer Cell. 2003; 3: 213-217Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (538) Google Scholar, 6Bagatell R. Whitesell L. Mol. Cancer Ther. 2004; 3: 1021-1030Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar). Consistent with this, treatment with LAQ824 increased Bcr-Abl accumulation in the detergent-insoluble fraction, which was further enhanced by co-treatment with the proteasome inhibitor PS341 (bortezomib) (Fig. 2B). Additionally, treatment of K562 cells with LAQ824 increased the polyubiquitylation of proteins in the Bcr-Abl-containing immunoprecipitates with anti-Abl antibody (Fig. 2B). Increased polyubiquitylation of proteins was also seen following treatment with PS341 or following co-treatment with LAQ824 and PS341 (Fig. 2B). Consistent with this finding, treatment with LAQ824 depleted the levels of Bcr-Abl in K562 cells (Fig. 2C). As also reported previously, LAQ824 treatment depleted c-Raf and AKT levels (18Nimmanapalli R. Fuino L. Bali P. Gasparetto M. Glozak M. Tao J. Moscinski L. Smith C. Wu J. Jove R. Atadja P. Bhalla K. Cancer Res. 2003; 63: 5126-5135PubMed Google Scholar, 19Fuino L. Bali P. Wittmann S. Donapaty S. Guo F. Yamaguchi H. Wang H.-G. Atadja P. Bhalla K. Mol. Cancer Ther. 2003; 2: 971-984PubMed Google Scholar), while concomitantly inducing the levels of the acetylated α-tubulin and p21 in a dose-dependent manner (Fig. 2C).Fig. 2LAQ824 shifts the chaperone association of Bcr-Abl from HSP90 to HSP70, resulting in polyubiquitylation and proteasomal degradation of Bcr-Abl. A, K562 cells were treated with the indicated concentration of LAQ824 for 16 h. Then immunoprecipitates (IP) of Bcr-Abl from the cell lysates were immunoblotted (IB) with anti-HSP90, anti-Hsp70, or anti-Abl antibodies. B, K562 cells were treated with the indicated concentrations of LAQ824 and/or PS341 (bortezomib) for 16 h. Then immunoprecipitates of Bcr-Abl from the cell lysates were immunoblotted with anti-ubiquitin or anti-Abl antibodies. Additionally, following treatment of K562 cells with LAQ824 and/or PS341, the detergent (Nonidet P-40)-insoluble fractions were obtained and immunoblotted with anti-Abl antibody. The levels of β-actin served as the loading control. C, K562 cells were treated with the indicated concentrations of LAQ824 for 16 h. Then the cell lysates were immunoblotted with anti-acetyl α-tubulin, p21, Abl, c-Raf, or anti-AKT antibody. The levels of β-actin served as the loading control.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Simultaneous induction of the acetylation of α-tubulin and HSP90 by LAQ824 raised the possibility that inhibition of HDAC6 may be responsible for LAQ824-mediated acetylation and inhibition of the chaperone function of HSP90. To address this issue, we first determined whether HDAC6 is co-immunoprecipitated with HSP90. As shown in Fig. 3A, in K562 cells HDAC6 could be co-immunoprecipitated with HSP90. Treatment with LAQ824 or LBH589 for 16 h, but not treatment with sodium butyrate, reduced the amount of HDAC6 that could be co-immunoprecipitated with HSP90, as estimated by densitometry (Fig. 3A). LAQ824 but not trapoxin treatment was associated with a slight increase in the levels of HDAC6, whereas neither drug significantly affected the levels of HDAC10 (the HDAC most closely related to HDAC6) (data not shown). We next determined the effect of the ectopic overexpression of HDAC6 on LAQ824-induced acetylation of α-tubulin and HSP90 and on induction of p21 in K562 cells. A FLAG-tagged cDNA of HDAC6 was transfected in K562 cells, and the transient expression of FLAG and the overexpression of HDAC6 were confirmed in K562/HDAC6 cells (Fig. 3B). As compared with the vector alone-transfected control K562 cells, a 2-fold increase in HDAC6 expression was detected in K562/HDAC6 cells. The discrepancy between FLAG expression and only a 2-fold overexpression of HDAC6 may be because the anti-HDAC6 antibody poorly recognized its epitope in the FLAG-tagged version of HDAC6. No significant change in the HDAC10 levels was observed in K562/HDAC6 cells (Fig. 3B). As compared with the control K562, LAQ824-mediated increase in the levels of acetylated α-tubulin but not of p21 was blunted in K562/HDAC6 cells (Fig. 3B). LAQ824 treatment did not significantly affect HDAC6 or HDAC10 expression in K562/HDAC6 and K562/control cells. Importantly, ectopic overexpression of HDAC6 also inhibited LAQ824-induced HSP90 acetylation in K562/HDAC6 cells (Fig. 3C). Concomitantly, as compared with the effect of LAQ824 in K562/control cells, a lesser LAQ824-mediated attenuation of Bcr-Abl and c-Raf levels was observed in K562/HDAC6 cells (Fig. 3D).Fig. 3HDAC6 binds to HSP90, and ectopic overexpression of HDAC6 inhibits LAQ824-mediated acetylation of α-tubulin and HSP90. A, K562 cells were treated with the indicated concentrations of HAA-HDI LAQ824 or LBH589 or with sodium butyrate for 16 h. Then total cell lysates were prepared and immunoprecipitated (IP) to HSP90 or the control rat IgG. Immunoblot analysis (IB) was performed with either anti-HSP90 or anti-HDAC6 antibody. B, K562 cells were transiently transfected with pCDNA3.1 vector containing FLAG-tagged HDAC6 (K562/HDAC6) or the vector alone (K562/vector) over 48 h. Then the cells were treated with 250 nm LAQ824 for 16 h. After this treatment, the cell lysates were immuno

Abstract Histone deacetylase (HDAC) enzymatic activity has been linked to the transcription of DNA in cancers including multiple myeloma (MM). Therefore, HDAC inhibitors used alone and in combination are being actively studied as novel therapies in MM. In the present study, we investigated the preclinical activity of ACY-1215, an HDAC6-selective inhibitor, alone and in combination with bortezomib in MM. Low doses of ACY-1215 combined with bortezomib triggered synergistic anti-MM activity, resulting in protracted endoplasmic reticulum stress and apoptosis via activation of caspase-3, caspase-8, and caspase-9 and poly (ADP) ribosome polymerase. In vivo, the anti-MM activity of ACY-1215 in combination with bortezomib was confirmed using 2 different xenograft SCID mouse models: human MM injected subcutaneously (the plasmacytoma model) and luciferase-expressing human MM injected intravenously (the disseminated MM model). Tumor growth was significantly delayed and overall survival was significantly prolonged in animals treated with the combination therapy. Pharmacokinetic data showed peak plasma levels of ACY-1215 at 4 hours after treatment coincident with an increase in acetylated α-tubulin, a marker of HDAC6 inhibition, by immunohistochemistry and Western blot analysis. These studies provide preclinical rationale for acetylated α-tubulin use as a pharmacodynamic biomarker in future clinical trials.

Heart failure (HF) is driven by the interplay between regulatory transcription factors and dynamic alterations in chromatin structure. Pathologic gene transactivation in HF is associated with recruitment of histone acetyl-transferases and local chromatin hyperacetylation. We therefore assessed the role of acetyl-lysine reader proteins, or bromodomains, in HF. Using a chemical genetic approach, we establish a central role for BET family bromodomain proteins in gene control during HF pathogenesis. BET inhibition potently suppresses cardiomyocyte hypertrophy in vitro and pathologic cardiac remodeling in vivo. Integrative transcriptional and epigenomic analyses reveal that BET proteins function mechanistically as pause-release factors critical to expression of genes that are central to HF pathogenesis and relevant to the pathobiology of failing human hearts. This study implicates epigenetic readers as essential effectors of transcriptional pause release during HF pathogenesis and identifies BET coactivator proteins as therapeutic targets in the heart.

Restoration of anti-tumor immunity by blocking PD-L1 signaling through the use of antibodies has proven to be beneficial in cancer therapy. Here, we show that BET bromodomain inhibition suppresses PD-L1 expression and limits tumor progression in ovarian cancer. CD274 (encoding PD-L1) is a direct target of BRD4-mediated gene transcription. In mouse models, treatment with the BET inhibitor JQ1 significantly reduced PD-L1 expression on tumor cells and tumor-associated dendritic cells and macrophages, which correlated with an increase in the activity of anti-tumor cytotoxic T cells. The BET inhibitor limited tumor progression in a cytotoxic T-cell-dependent manner. Together, these data demonstrate a small-molecule approach to block PD-L1 signaling. Given the fact that BET inhibitors have been proven to be safe with manageable reversible toxicity in clinical trials, our findings indicate that pharmacological BET inhibitors represent a treatment strategy for targeting PD-L1 expression.

The efficacy of proteasome inhibition for myeloma is limited by therapeutic resistance, which may be mediated by activation of the autophagy pathway as an alternative mechanism of protein degradation. Preclinical studies demonstrate that autophagy inhibition with hydroxychloroquine augments the antimyeloma efficacy of the proteasome inhibitor bortezomib. We conducted a phase I trial combining bortezomib and hydroxychloroquine for relapsed or refractory myeloma. We enrolled 25 patients, including 11 (44%) refractory to prior bortezomib. No protocol-defined dose-limiting toxicities occurred, and we identified a recommended phase 2 dose of hydroxychloroquine 600 mg twice daily with standard doses of bortezomib, at which we observed dose-related gastrointestinal toxicity and cytopenias. Of 22 patients evaluable for response, 3 (14%) had very good partial responses, 3 (14%) had minor responses, and 10 (45%) had a period of stable disease. Electron micrographs of bone marrow plasma cells collected at baseline, after a hydroxychloroquine run-in, and after combined therapy showed therapy-associated increases in autophagic vacuoles, consistent with the combined effects of increased trafficking of misfolded proteins to autophagic vacuoles and inhibition of their degradative capacity. Combined targeting of proteasomal and autophagic protein degradation using bortezomib and hydroxychloroquine is therefore feasible and a potentially useful strategy for improving outcomes in myeloma therapy.

A small set of core transcription factors (TFs) dominates control of the gene expression program in embryonic stem cells and other well-studied cellular models. These core TFs collectively regulate their own gene expression, thus forming an interconnected auto-regulatory loop that can be considered the core transcriptional regulatory circuitry (CRC) for that cell type. There is limited knowledge of core TFs, and thus models of core regulatory circuitry, for most cell types. We recently discovered that genes encoding known core TFs forming CRCs are driven by super-enhancers, which provides an opportunity to systematically predict CRCs in poorly studied cell types through super-enhancer mapping. Here, we use super-enhancer maps to generate CRC models for 75 human cell and tissue types. These core circuitry models should prove valuable for further investigating cell-type–specific transcriptional regulation in healthy and diseased cells.

AbstractFoxp3+ T-regulatory cells (Tregs) are key to immune homeostasis such that their diminished numbers or function can cause autoimmunity and allograft rejection. Foxp3+ Tregs express multiple histone/protein deacetylases (HDACs) that regulate chromatin remodeling, gene expression, and protein function. Pan-HDAC inhibitors developed for oncologic applications enhance Treg production and Treg suppression function but have limited nononcologic utility given their broad actions and various side effects. We show, using HDAC6-deficient mice and wild-type (WT) mice treated with HDAC6-specific inhibitors, that HDAC6 inhibition promotes Treg suppressive activity in models of inflammation and autoimmunity, including multiple forms of experimental colitis and fully major histocompatibility complex (MHC)-incompatible cardiac allograft rejection. Many of the beneficial effects of HDAC6 targeting are also achieved by inhibition of the HDAC6-regulated protein heat shock protein 90 (HSP90). Hence, selective targeting of a single HDAC isoform, HDAC6, or its downstream target, HSP90, can promote Treg-dependent suppression of autoimmunity and transplant rejection.View publisher note:Articles of Significant Interest Selected from This Issue by the Editors ACKNOWLEDGMENTSThis work was supported by research grants from the National Institutes of Health (K08DK080189 to E.F.D. and P01AI073489 to W.W.H.) and CDHNF/CCFA (2712) grants to E.F.D.We thank Kapil Bhalla for the gift of anti-acetylated HSP90 Ab.

Summary Drugs that block the activity of the methyltransferase EZH2 are in clinical development for the treatment of non-Hodgkin lymphomas harboring gain-of-function EZH2 mutations that enhance its polycomb repressive function. In contrast, in castration-resistant prostate cancer (CRPC) we have previously reported that EZH2 plays a non-canonical role as a transcriptional activator. In this setting, we now show that EZH2 inhibitors can also block the non-canonical activity of EZH2 and inhibit the growth of CRPC cells. Gene expression and epigenomic profiling of cells treated with EZH2 inhibitors demonstrated that rather than de-repressing tumor suppressor genes silenced by PRC2, EZH2 inhibitors downregulate a set of DNA repair genes that are directly regulated by EZH2. In addition, genome-wide CRISPR/Cas9-mediated loss-of-function screens in the presence of EZH2 inhibitors identified these DNA repair genes to underlie the growth-inhibitory function of these compounds. Interrogation of public data from diverse solid tumor types expressing wild-type EZH2 showed that expression of DNA damage repair genes is significantly correlated with cellular sensitivity to EZH2 inhibitors. Consistent with these findings, treatment of CRPC cells with EZH2 inhibitors dramatically enhanced their sensitivity to genotoxic stress. These studies reveal a previously unappreciated mechanism of action of EZH2 inhibitors and provide a mechanistic basis for potential new combination cancer therapies.