ABSTRACT Infections with Trypanosoma cruzi are usually life-long despite generating a strong adaptive immune response. Identifying the sites of parasite persistence is therefore crucial to understand how T. cruzi avoids immune-mediated destruction. However, this is a major technical challenge because the parasite burden during chronic infections is extremely low. Here, we describe an integrated approach involving comprehensive tissue processing, ex vivo imaging, and confocal microscopy, which has allowed us to visualise infected host cells in murine tissue, with exquisite sensitivity. Using bioluminescence-guided tissue sampling, with a detection level of <20 parasites, we show that in the colon, smooth muscle myocytes in the circular muscle layer are the most common infected host cell type. Typically, during chronic infections, the entire colon of a mouse contains only a few hundred parasites, often concentrated in a small number of cells containing >200 parasites, that we term mega-nests. In contrast, during the acute stage, when the total parasite burden is considerably higher and many cells are infected, nests containing >50 parasites are rarely found. In C3H/HeN mice, but not BALB/c, we identified skeletal muscle as a major site of persistence during the chronic stage, with most parasites found in large mega-nests within the muscle fibres. Finally, we report that parasites are also frequently found in the skin during chronic murine infections, often in multiple infection foci. In addition to being a site of parasite persistence, this anatomical reservoir could play an important role in insect-mediated transmission, and have implications for drug development. IMPORTANCE Trypanosoma cruzi causes Chagas disease, the most important parasitic infection in Latin America. Major pathologies include severe damage to the heart and digestive tract, although symptoms do not usually appear until decades after infection. Research has been hampered by the complex nature of the disease and technical difficulties in locating the extremely low number of parasites. Here, using highly sensitive imaging technology, we reveal the sites of parasite persistence in experimental mice at single-cell resolution. We show that parasites are frequently located in smooth muscle cells in the circular muscle layer of the colon, and that skeletal muscle cells and the skin can also be important reservoirs. This information provides a framework for investigating how the parasite is able to survive as a life-long infection, despite a vigorous immune response. It also informs drug-development strategies by identifying tissue sites that must be accessed to achieve a curative outcome.

Abstract Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas disease. Following T cell mediated suppression of the acute phase infection, this intracellular eukaryotic pathogen persists in a limited sub-set of tissues at extremely low-levels. The reasons for this tissue-specific chronicity are not understood. Using a dual bioluminescent:fluorescent reporter strain, which allows experimental infections to be imaged at single-cell resolution, we have characterised the ‘hyper-local’ immunological microenvironment of rare parasitized cells in the mouse colon, a key site of persistence. We demonstrate that incomplete recruitment of T cells to infection foci permits the occurrence of repeated cycles of intracellular parasite replication and differentiation to motile trypomastigotes at a frequency sufficient to perpetuate chronic infections. The life-long persistence of parasites in this tissue site continues despite the presence, at a systemic level, of a highly effective T cell response. Overcoming this low-level dynamic host:parasite equilibrium represents a major challenge for vaccine development.

Abstract Chronic Trypanosoma cruzi infections are typically life-long, with small numbers of parasites surviving in restricted tissue sites, which include the gastro-intestinal tract. There is considerable debate about the replicative status of these persistent parasites. Here, we investigated T. cruzi proliferation in the colon of chronically infected mice using 5-ethynyl-2’deoxyuridine incorporation into DNA to provide “snapshots” of parasite replication. Highly sensitive imaging of infection foci at single cell resolution revealed that parasites are three times more likely to be in S-phase during the acute stage than during the chronic stage. By implication, chronic infections are associated with a reduced rate of parasite replication. Despite this, very few host cells survive infection for >14 days, suggesting that T. cruzi persistence continues to involve regular cycles of replication, host cell lysis and re-infection. Therefore, long-term persistence in the colon is more likely to be associated with reduced proliferation than with dormancy.

Abstract Benznidazole is the front-line drug used to treat infections with Trypanosoma cruzi , the causative agent of Chagas disease. However, for reasons that are unknown, treatment failures are common. To assess the nature of parasites that persist after treatment, we first exposed infected mammalian cell monolayers to a benznidazole regimen that reduces the intracellular amastigote population to <1% of the pre-treatment level. Of host cells that remained infected, the vast majority contained only one or two surviving intracellular amastigotes. Analysis, using incorporation of the thymidine analogue EdU, revealed these surviving parasites to be in a transient non-replicative state. Furthermore, treatment with benznidazole led to widespread damage to parasite DNA. When parasites that survived treatment in mice were examined using in vivo and ex vivo bioluminescence imaging, we found that recrudescence is not due to persistence of parasites in a specific organ or tissue that preferentially protects them from drug activity. Surviving parasites were widely distributed and located in host cells where the vast majority contained only one or two amastigotes. Therefore, infection relapse does not arise from a small number of intact large nests. Rather, persisters are either survivors of intracellular populations where co-located parasites have been killed, or amastigotes in single/low-level infected cells exist in a state where they are less susceptible to benznidazole. Assessment by EdU incorporation revealed that the small number of parasites which persist in mice after treatment are initially non-replicative. A possible explanation could be that triggering of the T. cruzi DNA damage response pathway by the activity of benznidazole metabolites results in exit from the cell cycle as parasites attempt DNA repair, and that metabolic changes associated with non-proliferation act to reduce drug susceptibility. Alternatively, a small percentage of the parasite population may pre-exist in this non-replicative state prior to treatment. Author Summary Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease, the most important parasitic infection in Latin America. For reasons that are not established, the front-line drug benznidazole often fails to achieve sterile cure. Here, we used highly sensitive imaging technology to investigate the impact of benznidazole on T. cruzi infected mice. Following non-curative treatment, we found that persistence is not restricted to a specific organ or tissue that preferentially protects the parasite from drug activity. Rather, surviving parasites are widely distributed, although overall tissue levels are extremely low. These persisters are located in host cells that typically contain only one or two non-replicating intracellular amastigotes. However, these parasites re-initiate DNA replication within several days of treatment cessation and begin to proliferate. Therefore, being in a non-replicative state seems to confer protection against drug-mediated trypanocidal activity. Benznidazole treatment results in widespread damage to parasite DNA. One possibility therefore, is that this triggers the T. cruzi DNA damage response pathway, resulting in exit from the cell cycle as parasites attempt DNA repair. Alternatively, persisters may be derived from a small parasite sub-population that pre-exists in a non-replicative state prior to treatment.

Investigations into intracellular replication and differentiation of Trypanosoma cruzi within the mammalian host have been restricted by limitations in our ability to detect parasitized cells throughout the course of infection. We have overcome this problem by generating genetically modified parasites that express a bioluminescent/fluorescent fusion protein. By combining in vivo imaging and confocal microscopy, this has enabled us to routinely visualise murine infections at the level of individual host cells. These studies reveal that intracellular parasite replication is an asynchronous process, irrespective of tissue location or disease stage. Furthermore, using TUNEL assays and EdU labelling, we demonstrate that within individual infected cells, replication of both mitochondrial (kDNA) and nuclear genomes is not co-ordinated within the parasite population, and that replicating amastigotes and non-replicating trypomastigotes can co-exist in the same cell. Finally, we report the presence of distinct non-canonical morphological forms of T. cruzi in the mammalian host. These appear to represent transitional forms in the amastigote to trypomastigote differentiation process. Therefore, the intracellular life-cycle of T. cruzi in vivo is more complex than previously realised, with potential implications for our understanding of disease pathogenesis, immune evasion and drug development. Dissecting the mechanisms involved will be an important experimental challenge