Double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) serves as a danger signal associated with viral infection and leads to stimulation of innate immune cells. In contrast, the immunostimulatory potential of single-stranded RNA (ssRNA) is poorly understood and innate immune receptors for ssRNA are unknown. We report that guanosine (G)- and uridine (U)-rich ssRNA oligonucleotides derived from human immunodeficiency virus–1 (HIV-1) stimulate dendritic cells (DC) and macrophages to secrete interferon-α and proinflammatory, as well as regulatory, cytokines. By using Toll-like receptor (TLR)–deficient mice and genetic complementation, we show that murine TLR7 and human TLR8 mediate species-specific recognition of GU-rich ssRNA. These data suggest that ssRNA represents a physiological ligand for TLR7 and TLR8.

Abstract The dendritic cells (DC) of mouse spleen and thymus were examined for expression of CD4 and CD8. Provided care was taken to avoid selective extraction or selective depletion of DC subpopulations, three main types of DC were detected in mouse spleen: a major new population of CD4+8− DEC-205low CD11bhigh DC, together with the previously described CD4−8− DEC-205low CD11bhigh DC and CD4−8αα+ DEC-205high CD11blow DC. The CD4 on the surface of the CD4+ splenic DC subpopulation was produced by the DC themselves, and CD4 RNA transcripts were present. Likewise, the CD8α on the surface of the splenic CD8+ DC was shown to be a product of the DC themselves, in agreement with earlier evidence. All three spleen DC types would be considered as mature, based on expression of CD80, CD86, and CD40 as well as on T cell stimulating function. Mouse thymuses appeared to contain two DC types; both were DEC-205highCD11blow, but they differed in the level of CD8αα expression. However, as well as this authenticated marker expression, immunofluorescent staining was also found to reflect a series of artifacts, due to the autofluorescence of contaminating cells and due to pickup of CD4 and CD8αβ. By constructing mice chimeric for the hemopoietic lineages using mixtures of wild-type bone marrow with CD4null or CD8αnull bone marrow, a marked pickup by thymic DC of Ags derived from thymocytes was demonstrated.

Summary

 Dendritic cell (DC) populations consist of multiple subsets that are essential orchestrators of the immune system. Technological limitations have so far prevented systems-wide accurate proteome comparison of rare cell populations in vivo. Here, we used high-resolution mass spectrometry-based proteomics, combined with label-free quantitation algorithms, to determine the proteome of mouse splenic conventional and plasmacytoid DC subsets to a depth of 5,780 and 6,664 proteins, respectively. We found mutually exclusive expression of pattern recognition pathways not previously known to be different among conventional DC subsets. Our experiments assigned key viral recognition functions to be exclusively expressed in CD4⁺ and double-negative DCs. The CD8α⁺ DCs largely lack the receptors required to sense certain viruses in the cytoplasm. By avoiding activation via cytoplasmic receptors, including retinoic acid-inducible gene I, CD8α⁺ DCs likely gain a window of opportunity to process and present viral antigens before activation-induced shutdown of antigen presentation pathways occurs.

Abstract Loxoribine (7‐allyl‐7,8‐dihydro‐8‐oxo‐guanosine) acts as synthetic adjuvant in anti‐tumor responses. Here we first demonstrate that loxoribine activates cells of the innate immune system selectively via the Toll‐like receptor (TLR) 7/MyD88‐dependent signaling pathway. TLR7‐ and MyD88‐deficient immune cells fail to proliferate or produce cytokines in response to loxoribine, and genetic complementation of TLR7‐deficient cells with murine or human TLR7 confers responsiveness. Subsequently we show that cellular activation by loxoribine and resiquimod (R‐848), a stimulus for TLR7 and TLR8, depends on acidification and maturation of endosomes and targets MyD88 to vesicular structures with lysosomal characteristics. This mode of TLR7 and TLR8 action resembles CpG‐DNA‐driven TLR9 activation. We thus conclude that TLR7, 8 and 9 form a functional subgroup within the TLR family that recognizes pathogen‐associated molecular patterns in endosomal/lysosomal compartments.

Abstract Dendritic cells (DC) not only stimulate T cells effectively but are also producers of cytokines that have important immune regulatory functions. In this study we have extended information on the functional differences between DC subpopulations to include differences in the production of the major immune-directing cytokines IL-12, IFN-α, and IFN-γ. Splenic CD4−8+ DC were identified as the major IL-12 producers in response to microbiological or T cell stimuli when compared with splenic CD4−8− or CD4+8− DC; however, all three subsets of DC showed similar IL-12 regulation and responded with increased IL-12 p70 production if IL-4 was present during stimulation. High level CD8 expression also correlated with extent of IL-12 production for DC isolated from thymus and lymph nodes. By using gene knockout mice we ruled out any role for CD8α itself, or of priming by T cells, on the superior IL-12-producing capacity of the CD8+ DC. Additionally, CD8+ DC were identified as the major producers of IFN-α compared with the two CD8− DC subsets, a finding that suggests similarity to the human plasmacytoid DC lineage. In contrast, the CD4−8− DC produced much more IFN-γ than the CD4−8+ or the CD4+8− DC under all conditions tested.

Type I IFN production in response to the DNA virus herpes simplex virus type-1 (HSV-1) is essential in controlling viral replication. We investigated whether plasmacytoid dendritic cells (pDC) were the major tissue source of IFN-α, and whether the production of IFN-α in response to HSV-1 depended on Toll-like receptor 9 (TLR9). Total spleen cells or bone marrow (BM) cells, or fractions thereof, including highly purified pDC, from WT, TLR9, and MyD88 knockout mice were stimulated with known ligands for TLR9 or active HSV-1. pDC freshly isolated from both spleen and BM were the major source of IFN-α in response to oligodeoxynucleotides containing CpG motifs, but in response to HSV-1 the majority of IFN-α was produced by other cell types. Moreover, IFN-α production by non-pDC was independent of TLR9. The tissue source determined whether pDC responded to HSV-1 in a strictly TLR9-dependent fashion. Freshly isolated BM pDC or pDC derived from culture of BM precursors with FMS-like tyrosine kinase-3 ligand, produced IFN-α in the absence of functional TLR9, whereas spleen pDC did not. Heat treatment of HSV-1 abolished maturation and IFN-α production from all TLR9-deficient DC but not WT DC. Thus pDC and non-pDC produce IFN-α in response to HSV-1 via both TLR9-independent and -dependent pathways.

A Double Escapee Toll-like receptors (TLRs)—TLR2 and TLR7—are thought to contribute to the sensing of Gram-positive bacteria like Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae by the immune system. Mice deficient in these receptors, however, are still sensitive to infection with these bacteria. Oldenburg et al. (p. 1111 , published online 19 July) demonstrate that TLR13 also plays a role in detecting Gram-positive bacteria. TLR13 recognized a conserved region in the peptidyl transferase loop of bacterial 23S ribosomal RNA. Intriguingly, this same sequence is modified by specific methyltransferases that confer resistance to erythromycin. Indeed, erythromycin-resistant bacteria were no longer detectible by TLR13.

The CD45RA(hi)CD11c(int) plasmacytoid predendritic cells (p-preDCs) of mouse lymphoid organs, when stimulated in culture with CpG or influenza virus, produce large amounts of type I interferons and transform without division into CD8(+)CD205(-) DCs. P-preDCs express CIRE, the murine equivalent of DC-specific intercellular adhesion molecule 3 grabbing nonintegrin (DC-SIGN). P-preDCs are divisible by CD4 expression into two subgroups differing in turnover rate and in response to Staphylococcus aureus. The kinetics of bromodeoxyuridine labeling and the results of transfer to normal recipient mice indicate that CD4(-) p-preDCs are the immediate precursors of CD4(+) p-preDCs. Similar experiments indicate that p-preDCs are normally long lived and are not the precursors of the short-lived steady-state conventional DCs. However, in line with the culture studies on transfer to influenza virus-stimulated mice the p-preDCs transform into CD8(+)CD205(-) DCs, distinct from conventional CD8(+)CD205(+) DCs. Hence as well as activating preexistant DCs, microbial infection induces a wave of production of a new DC subtype. The functional implications of this shift in the DC network remain to be determined.

Smallpox eradication, coordinated by the WHO and certified 40 years ago, led to the cessation of routine smallpox vaccination in most countries. It is estimated that over 70% of the world's population is no longer protected against smallpox, and through cross-immunity, to closely related orthopox viruses such as monkeypox. Monkeypox is now a re-emerging disease. Monkeypox is endemic in as yet unconfirmed animal reservoirs in sub-Saharan Africa, while its human epidemiology appears to be changing. Monkeypox in small animals imported from Ghana as exotic pets was at the origin of an outbreak of human monkeypox in the USA in 2003. Travellers infected in Nigeria were at the origin of monkeypox cases in the UK in 2018 and 2019, Israel in 2018 and Singapore in2019. Together with sporadic reports of human infections with other orthopox viruses, these facts invite speculation that emergent or re-emergent human monkeypox might fill the epidemiological niche vacated by smallpox. An ad-hoc and unofficial group of interested experts met to consider these issues at Chatham House, London in June 2019, in order to review available data and identify monkeypox-related research gaps. Gaps identified by the experts included:The experts further agreed on the need for a better understanding of the genomic evolution and changing epidemiology of orthopox viruses, the usefulness of in-field genomic diagnostics, and the best disease control strategies, including the possibility of vaccination with new generation non-replicating smallpox vaccines and treatment with recently developed antivirals.

Polyinosinic:polycytidylic acid (poly IC), a double-stranded RNA, is an effective adjuvant in vivo. IFN-λs (also termed IL-28/29) are potent immunomodulatory and antiviral cytokines. We demonstrate that poly IC injection in vivo induces large amounts of IFN-λ, which depended on hematopoietic cells and the presence of TLR3 (Toll-like receptor 3), IRF3 (IFN regulatory factor 3), IRF7, IFN-I receptor, Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (FL), and IRF8 but not on MyD88 (myeloid differentiation factor 88), Rig-like helicases, or lymphocytes. Upon poly IC injection in vivo, the IFN-λ production by splenocytes segregated with cells phenotypically resembling CD8α+ conventional dendritic cells (DCs [cDCs]). In vitro experiments revealed that CD8α+ cDCs were the major producers of IFN-λ in response to poly IC, whereas both CD8α+ cDCs and plasmacytoid DCs produced large amounts of IFN-λ in response to HSV-1 or parapoxvirus. The nature of the stimulus and the cytokine milieu determined whether CD8α+ cDCs produced IFN-λ or IL-12p70. Human DCs expressing BDCA3 (CD141), which is considered to be the human counterpart of murine CD8α+ DCs, also produced large amounts of IFN-λ upon poly IC stimulation. Thus, IFN-λ production in response to poly IC is a novel function of mouse CD8α+ cDCs and their human equivalents.