FLT3 receptor tyrosine kinase is expressed on lymphoid and myeloid progenitors in the hematopoietic system. Activating mutations in FLT3 have been identified in approximately 30% of patients with acute myelogenous leukemia, making it one of the most common mutations observed in this disease. Frequently, the mutation is an in-frame internal tandem duplication (ITD) in the juxtamembrane region that results in constitutive activation of FLT3, and confers interleukin-3 (IL-3)–independent growth to Ba/F3 and 32D cells. FLT3-ITD mutants were cloned from primary human leukemia samples and assayed for transformation of primary hematopoietic cells using a murine bone marrow transplantation assay. FLT3-ITDs induced an oligoclonal myeloproliferative disorder in mice, characterized by splenomegaly and leukocytosis. The myeloproliferative phenotype, which was associated with extramedullary hematopoiesis in the spleen and liver, was confirmed by histopathologic and flow cytometric analysis. The disease latency of 40 to 60 days with FLT3-ITDs contrasted with wild-type FLT3 and enhanced green fluorescent protein (EGFP) controls, which did not develop hematologic disease (> 200 days). These results demonstrate that FLT3-ITD mutant proteins are sufficient to induce a myeloproliferative disorder, but are insufficient to recapitulate the AML phenotype observed in humans. Additional mutations that impair hematopoietic differentiation may be required for the development of FLT3-ITD–associated acute myeloid leukemias. This model system should be useful to assess the contribution of additional cooperating mutations and to evaluate specific FLT3 inhibitors in vivo.

Abstract The glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor is a validated drug target for metabolic disorders. Ago-allosteric modulators are capable of acting both as agonists on their own and as efficacy enhancers of orthosteric ligands. However, the molecular details of ago-allosterism remain elusive. Here, we report three cryo-electron microscopy structures of GLP-1R bound to (i) compound 2 (an ago-allosteric modulator); (ii) compound 2 and GLP-1; and (iii) compound 2 and LY3502970 (a small molecule agonist), all in complex with heterotrimeric G s . The structures reveal that compound 2 is covalently bonded to C347 at the cytoplasmic end of TM6 and triggers its outward movement in cooperation with the ECD whose N terminus penetrates into the GLP-1 binding site. This allows compound 2 to execute positive allosteric modulation through enhancement of both agonist binding and G protein coupling. Our findings offer the structural basis of ago-allosterism at GLP-1R and new knowledge to design better therapeutics.

Abstract Glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R) agonists are effective in treating type 2 diabetes and obesity with proven cardiovascular benefits. However, most of them are peptides and require subcutaneous injection except for orally available semaglutide. Boc5 was identified as the first orthosteric non-peptidic agonist of GLP-1R that mimics a broad spectrum of bioactivities of GLP-1 in vitro and in vivo . Here, we report the cryo-electron microscopy structures of Boc5 and its analog WB4-24 in complex with the human GLP-1R and G s protein. Bound to the extracellular domain, extracellular loop 2, and transmembrane (TM) helices 1, 2, 3 and 7, one arm of both compounds inserted deeply into the bottom of the orthosteric binding pocket that is usually accessible by peptidic agonists, thereby partially overlapping with the residues A8-D15 in GLP-1. The other three arms, meanwhile, extended to the TM1-TM7, TM1-TM2, and TM2-TM3 clefts showing an interaction feature substantially similar to a previously known small molecule agonist LY3502970. Such a unique binding mode creates a distinct conformation that confers both peptidomimetic agonism and biased signaling induced by non-peptidic modulators at GLP-1R. Further, the conformational difference between Boc5 and WB4-24, two closed related compounds, provides a structural framework for fine tuning of pharmacological efficacy in the development of future small molecule therapeutics targeting GLP-1R. Significance GLP-1R agonists are efficacious in the treatment of type 2 diabetes and obesity. While most clinically used agents require subcutaneous injection, Boc5, as the first orthosteric non-peptidic agonist of GLP-1R, suffers from poor oral bioavailability that hinders its therapeutic development. The cryo-electron microscopy structures of Boc5 and its closely related analog WB4-24 presented here reveal a previously unknown binding pocket located deeper in the transmembrane domain for non-peptidic GLP-1R agonists. Molecular interaction with this site may facilitate a broad spectrum of in vivo agonistic activities, in addition to that with the upper helical bundles presumably responsible for biased signaling. These findings deepen our understanding of peptidomimetic agonism at GLP-1R and may help design better drug leads against this important target.

Abstract CD133 (prominin 1) is widely viewed as a cancer stem cell marker in association with drug resistance and cancer recurrence. Herein we report that with impaired RTK-Shp2 Ras-Erk signaling, heterogenous hepatocytes form clusters that manage to divide during liver regeneration. These hepatocytes are characterized by upregulated CD133 while negative for other progenitor cell markers. Pharmaceutical inhibition of proliferative signaling also induced CD133 expression in various cancer cell types, suggesting an inherent and common mechanism of stress response. Super-resolution and electron microscopy localize CD133 on intracellular vesicles that apparently migrate between cells, which we name “intercellsome”. Isolated CD133 + intercellsomes are enriched with mRNAs rather than miRNAs. Single-cell RNA sequencing reveals lower intracellular diversity (entropy) of mitogenic mRNAs in Shp2-deficient cells, which may be remedied by intercellular mRNA exchanges between CD133 + cells. CD133-deficient cells are more sensitive to proliferative signal inhibition in livers and intestinal organoids. These data suggest a mechanism of intercellular communication to compensate intracellular signal deficit in various cell types.