MicroRNAs (miRNAs) have important roles in diverse cellular processes, but little is known about their identity and functions during early mammalian development. Here, we show the effects of the loss of maternal inheritance of miRNAs following specific deletion of Dicer from growing oocytes. The mutant mature oocytes were almost entirely depleted of all miRNAs, and they failed to progress through the first cell division, probably because of disorganized spindle formation. By comparing single-cell cDNA microarray profiles of control and mutant oocytes, our data are compatible with the notion that a large proportion of the maternal genes are directly or indirectly under the control of miRNAs, which demonstrates that the maternal miRNAs are essential for the earliest stages of mouse embryonic development.

DNA methylation is an important epigenetic modification regulating various biological phenomena, including genomic imprinting and transposon silencing. It is known that methylation of the differentially methylated regions (DMRs) associated with paternally imprinted genes and of some repetitive elements occurs during male germ cell development in the mouse. We have performed a detailed methylation analysis of the paternally methylated DMRs (H19, Dlk1/Gtl2 and Rasgrf1), interspersed repeats [SineB1, intracisternal A particle (IAP) and Line1] and satellite repeats (major and minor) to determine the timing of this de novo methylation in male germ cells. Furthermore, we have examined the roles of the de novo methyltransferases (Dnmt3a and Dnmt3b) and related protein (Dnmt3L) in this process. We found that methylation of all DMRs and repeats occurred progressively in fetal prospermatogonia and was completed by the newborn stage. Analysis of newborn prospermatogonia from germline-specific Dnmt3a and Dnmt3b knockout mice revealed that Dnmt3a mainly methylates the H19 and Dlk1/Gtl2 DMRs and a short interspersed repeat SineB1. Both Dnmt3a and Dnmt3b were involved in the methylation of Rasgrf1 DMR and long interspersed repeats IAP and Line1. Only Dnmt3b was required for the methylation of the satellite repeats. These results indicate both common and differential target specificities of Dnmt3a and Dnmt3b in vivo. Finally, all these sequences showed moderate to severe hypomethylation in Dnmt3L-deficient prospermatogonia, indicating the critical function and broad specificity of this factor in de novo methylation.

Background MicroRNAs (miRNAs) are critical regulators of transcriptional and post-transcriptional gene silencing, which are involved in multiple developmental processes in many organisms. Apart from miRNAs, mouse germ cells express another type of small RNA, piwi-interacting RNAs (piRNAs). Although it has been clear that piRNAs play a role in repression of retrotransposons during spermatogenesis, the function of miRNA in mouse germ cells has been unclear. Methodology/Principal Findings In this study, we first revealed the expression pattern of miRNAs by using a real-time PCR-based 220-plex miRNA expression profiling method. During development of germ cells, miR-17-92 cluster, which is thought to promote cell cycling, and the ES cell-specific cluster encoding miR-290 to -295 (miR-290-295 cluster) were highly expressed in primordial germ cells (PGCs) and spermatogonia. A set of miRNAs was developmentally regulated. We next analysed function of miRNA biogenesis in germ cell development by using conditional Dicer-knockout mice in which Dicer gene was deleted specifically in the germ cells. Dicer-deleted PGCs and spermatogonia exhibited poor proliferation. Retrotransposon activity was unexpectedly suppressed in Dicer-deleted PGCs, but not affected in the spermatogonia. In Dicer-deleted testis, spermatogenesis was retarded at an early stage when proliferation and/or early differentiation. Additionally, we analysed spermatogenesis in conditional Argonaute2-deficient mice. In contrast to Dicer-deficient testis, spermatogenesis in Argonaute2-deficient testis was indistinguishable from that in wild type. Conclusion/Significance These results illustrate that miRNAs are important for the proliferation of PGCs and spermatogonia, but dispensable for the repression of retrotransposons in developing germ cells. Consistently, miRNAs promoting cell cycling are highly expressed in PGCs and spermatogonia. Furthermore, based on normal spermatogenesis in Argonaute2-deficient testis, the critical function of Dicer in spermatogenesis is independent of Argonaute2.

Parental origin-specific DNA methylation regulates the monoallelic expression of the mammalian imprinted genes. The methylation marks or imprints are established in the parental germline and maintained throughout embryonic development. However, it is unclear how the methylation imprints are maintained through extensive demethylation in cleavage-stage preimplantation embryos. Previous reports suggested that DNA methyltransferase(s) other than Dnmt1 is involved in the maintenance of the imprints during cleavage. Here we demonstrate, by using conditional knockout mice, that the other known DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are dispensable for the maintenance of the methylation marks at most imprinted loci. We further demonstrate that a lack of both maternal and zygotic Dnmt1 results in complete demethylation of all imprinted loci examined in blastocysts. Consistent with these results we find that zygotic Dnmt1 is expressed in the preimplantation embryo. Thus, contrary to the previous reports, Dnmt1 alone is sufficient to maintain the methylation marks of the imprinted genes.

Mesenchymal stem cells (MSCs) exhibit multipotency, self-renewal, and immune-modulatory properties, making them promising in regenerative medicine, particularly in cardiovascular treatments. However, optimizing the MSC source and induction method of cardiac differentiation is challenging. This study compares the cardiomyogenic potential of bone marrow (BM)-MSCs and adipose-derived (AD)-MSCs using 5-Azacytidine (5-Aza) alone or combined with low doses of Fibroblast Growth Factor (FGF) and Insulin-like Growth Factor (IGF). BM-MSCs and AD-MSCs were differentiated using two protocols: 10 μmol 5-Aza alone and 10 μmol 5-Aza with 1 ng/mL FGF and 10 ng/mL IGF. Morphological, transcriptional, and translational analyses, along with cell viability assessments, were performed. Both the MSC types exhibited similar morphological changes; however, AD-MSCs achieved 70–80% confluence faster than BM-MSCs. Surface marker profiling confirmed CD29 and CD90 positivity and CD45 negativity. The differentiation protocols led to cell flattening and myotube formation, with earlier differentiation in AD-MSCs. The combined protocol reduced cell mortality in BM-MSCs and enhanced the expression of cardiac markers (MEF2c, Troponin I, GSK-3β), particularly in BM-MSCs. Immunofluorescence confirmed cardiac-specific protein expression in all the treated groups. Both MSC types exhibited the expression of cardiac-specific markers indicative of cardiomyogenic differentiation, with the combined treatment showing superior efficiency for BM-MSCs.

Although hyperplasia of the anorectal transitional zone (TZ) has been reported in mouse models of ulcerative colitis, the mechanisms underlying this phenomenon are not fully understood. We characterized keratin subtypes and examined the expression of stem cell markers in the TZ. Dextran sodium sulfate-treated mice showed abnormal repair of the anorectal region, which consisted of mixed hyperplastic TZ and regenerating crypts. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry from the paraffin-embedded TZ in the treated mice revealed that the major keratins were type I cytokeratin (CK)13 and type II CK5, but notable expression of type I CK10 and CK42 and type II CK1, CK4, CK6a, CK8, and CK15 was also detected. Hyperplastic TZ was characterized by the expression of tumor protein 63, sex-determining region Y-box 2 (SOX2), SOX9, and leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 (Lgr5). Lgr5 was highly expressed in the TZ in the early stages of colitis, followed by higher expression levels of SOX2. The TZ-derived organoids expressed LGR5, SOX2, and SOX9. The present study suggests that transitional zones showing abnormal keratin assembly and stem cell activation may interfere with rectal crypt regeneration, leading to pathological anorectal remodeling in severe colitis.