Proteasomal receptors that recognize ubiquitin chains attached to substrates are key mediators of selective protein degradation in eukaryotes. Here we report the identification of a new ubiquitin receptor, Rpn13/ARM1, a known component of the proteasome. Rpn13 binds ubiquitin through a conserved amino-terminal region termed the pleckstrin-like receptor for ubiquitin (Pru) domain, which binds K48-linked diubiquitin with an affinity of approximately 90 nM. Like proteasomal ubiquitin receptor Rpn10/S5a, Rpn13 also binds ubiquitin-like (UBL) domains of UBL-ubiquitin-associated (UBA) proteins. In yeast, a synthetic phenotype results when specific mutations of the ubiquitin binding sites of Rpn10 and Rpn13 are combined, indicating functional linkage between these ubiquitin receptors. Because Rpn13 is also the proteasomal receptor for Uch37, a deubiquitinating enzyme, our findings suggest a coupling of chain recognition and disassembly at the proteasome. The 26S proteasome is a multisubunit complex that selectively degrades ubiquitin conjugated proteins. Two studies show that a known component of the proteasome, Rpn13 functions as a novel ubiquitin binding receptor. Structural studies reveal a novel mode of ubiquitin recognition. Rpn 13 is also a receptor for a deubiquitinating enzyme, suggesting a linkage between ubiquitin chain recognition and disassembly. The 26S proteasome is a multisubunit complex that selectively degrades ubiquitin conjugated proteins. Two studies (this Article and the Letter Dikic doi:10.1038/nature06924) show that a known component of the proteasome, Rpn13, functions as a novel ubiquitin binding receptor, and structural studies reveal a novel mode of ubiquitin recognition. Rpn13 is also a receptor for a deubiquitinating enzyme, suggesting a linkage between ubiquitin chain recognition and disassembly.

Targeted protein degradation is largely performed by the ubiquitin-proteasome pathway, in which substrate proteins are marked by covalently attached ubiquitin chains that mediate recognition by the proteasome. It is currently unclear how the proteasome recognizes its substrates, as the only established ubiquitin receptor intrinsic to the proteasome is Rpn10/S5a (ref. 1), which is not essential for ubiquitin-mediated protein degradation in budding yeast. In the accompanying manuscript we report that Rpn13 (refs 3-7), a component of the nine-subunit proteasome base, functions as a ubiquitin receptor, complementing its known role in docking de-ubiquitinating enzyme Uch37/UCHL5 (refs 4-6) to the proteasome. Here we merge crystallography and NMR data to describe the ubiquitin-binding mechanism of Rpn13. We determine the structure of Rpn13 alone and complexed with ubiquitin. The co-complex reveals a novel ubiquitin-binding mode in which loops rather than secondary structural elements are used to capture ubiquitin. Further support for the role of Rpn13 as a proteasomal ubiquitin receptor is demonstrated by its ability to bind ubiquitin and proteasome subunit Rpn2/S1 simultaneously. Finally, we provide a model structure of Rpn13 complexed to diubiquitin, which provides insights into how Rpn13 as a ubiquitin receptor is coupled to substrate deubiquitination by Uch37.

The yin and yang of proteasomal regulation The ubiquitin-proteasome pathway regulates myriad proteins through their selective proteolysis. The small protein ubiquitin is attached, typically in many copies, to the target protein, which is then recognized and broken down by the proteasome. Shi et al. found a repeat structure in the proteasome for recognizing ubiquitin as well as ubiquitin-like (UBL) proteins. Tandem binding sites allow the proteasome to dock multiple proteins. One of the bound UBL proteins is an enzyme that cleaves ubiquitin-protein conjugates, which antagonizes degradation. Thus, the repetition of related binding sites with distinct specificity achieves a balance of positive and negative regulation of the proteasome. Science , this issue p. 10.1126/science.aad9421

Abstract The E3 ligase E6AP/UBE3A has a dedicated binding site in the 26S proteasome provided by the RAZUL domain of substrate receptor hRpn10/S5a/PSMD4. Guided by RAZUL sequence similarity, we test and demonstrate here that the E6AP AZUL binds transiently to the UBA of proteasomal shuttle factor UBQLN1/2. Despite a weak binding affinity, E6AP AZUL is recruited to UBQLN2 phase-separated droplets and E6AP interacts with UBQLN1/2 in cells. Steady-state and transfer NOE experiments indicate direct interaction of AZUL with the UBQLN1 UBA domain. Intermolecular contacts identified by NOESY data were combined with AlphaFold2-Multimer predictions to yield an AZUL:UBA model structure. We also identify a concentration-dependent oligomerization domain directly adjacent to UBQLN1/2 UBA (UBA-adjacent, UBAA) that is α-helical and allosterically reconfigured by AZUL binding to UBA. These data lead to a model of E6AP recruitment to UBQLN1/2 by AZUL:UBA interaction and provide fundamental information on binding requirements for interactions in droplets and cells.

Regulated proteolysis by the proteasome involves ~800 enzymes for substrate modification with ubiquitin, of which ~600 are E3 ligases. We report here that E6AP/UBE3A is distinguished from other ubiquitin E3 ligases by having a 12 nM binding site at the proteasome contributed by substrate receptor hRpn10/PSMD4/S5a. Intrinsically disordered by itself, and previously uncharacterized, this domain in hRpn10 locks into a novel well-defined helical structure to form an intermolecular 4-helix bundle with the E6AP AZUL domain, which is unique to this E3. We thus name the hRpn10 AZUL-binding domain RAZUL. We further find in human cells that loss of RAZUL by CRISPR-based gene editing leads to loss of E6AP at the proteasome, where associated ubiquitin is correspondingly reduced, suggesting that E6AP ubiquitinates substrates at or for the proteasome. Altogether, our findings indicate E6AP to be a privileged E3 for the proteasome, with a dedicated, high affinity binding site contributed by hRpn10.

Abstract Proteasome substrate receptor hRpn13 is a promising anti-cancer target. By integrated in silico and biophysical screening, we identified a chemical scaffold that binds hRpn13 with non-covalent interactions that mimic the proteasome and a weak electrophile for Michael addition. hRpn13 Pru domain binds proteasomes and ubiquitin whereas its DEUBAD domain binds deubiquitinating enzyme UCHL5. NMR revealed lead compound XL5 to interdigitate into a hydrophobic pocket created by lateral movement of a Pru β-hairpin with an exposed end for Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs). Implementing XL5-PROTACs as chemical probes identified a DEUBAD-lacking hRpn13 species (hRpn13 Pru ) present naturally with cell type-dependent abundance. XL5-PROTACs preferentially target hRpn13 Pru , causing its ubiquitination. Gene-editing and rescue experiments established hRpn13 requirement for XL5-PROTAC-triggered apoptosis and increased p62 levels. These data establish hRpn13 as an anti-cancer target for multiple myeloma and introduce an hRpn13-targeting scaffold that can be optimized for preclinical trials against hRpn13 Pru -producing cancer types.