The species complexity of microbial communities and challenges in culturing representative isolates make it difficult to obtain assembled genomes. Here we characterize and compare the metabolic capabilities of terrestrial and marine microbial communities using largely unassembled sequence data obtained by shotgun sequencing DNA isolated from the various environments. Quantitative gene content analysis reveals habitat-specific fingerprints that reflect known characteristics of the sampled environments. The identification of environment-specific genes through a gene-centric comparative analysis presents new opportunities for interpreting and diagnosing environments.

Wood-feeding higher termites are a very successful group, important in facilitating carbon turnover in the environment. It is not the termites themselves that perform the key reactions that makes their lifestyle possible, but the lignocellulase-degrading symbiotic bacteria found in their hindgut. A metagenomic analysis of gut microbes from over 150 tree-living termites from a Costa Rican rainforest has revealed a diverse range of bacterial cellulase and xylan hydrolase genes, as well as genes important in other symbiotic functions. The data set includes about 1,000 bacterial lignocellulose hydrolase enzymes, some of them expressed in situ, in living termites. This work shows that termites are a rich reservoir of bacterial enzymes that might be used in the conversion of woody material into biofuels. Wood-feeding 'higher' termites rely on their hindgut symbionts for the intitial steps in cellulose degradation. Metagenomic analysis of this microbial community reveals a diverse range of bacterial cellulase and hydrolase genes, as well as genes important in other metabolic functions, such as H2 metabolism, CO2-reductive acetogenesis and N2 fixation. From the standpoints of both basic research and biotechnology, there is considerable interest in reaching a clearer understanding of the diversity of biological mechanisms employed during lignocellulose degradation. Globally, termites are an extremely successful group of wood-degrading organisms1 and are therefore important both for their roles in carbon turnover in the environment and as potential sources of biochemical catalysts for efforts aimed at converting wood into biofuels. Only recently have data supported any direct role for the symbiotic bacteria in the gut of the termite in cellulose and xylan hydrolysis2. Here we use a metagenomic analysis of the bacterial community resident in the hindgut paunch of a wood-feeding ‘higher’ Nasutitermes species (which do not contain cellulose-fermenting protozoa) to show the presence of a large, diverse set of bacterial genes for cellulose and xylan hydrolysis. Many of these genes were expressed in vivo or had cellulase activity in vitro, and further analyses implicate spirochete and fibrobacter species in gut lignocellulose degradation. New insights into other important symbiotic functions including H2 metabolism, CO2-reductive acetogenesis and N2 fixation are also provided by this first system-wide gene analysis of a microbial community specialized towards plant lignocellulose degradation. Our results underscore how complex even a 1-μl environment can be.

The SAR11 clade consists of very small, heterotrophic marine α-proteobacteria that are found throughout the oceans, where they account for about 25% of all microbial cells. Pelagibacter ubique , the first cultured member of this clade, has the smallest genome and encodes the smallest number of predicted open reading frames known for a free-living microorganism. In contrast to parasitic bacteria and archaea with small genomes, P. ubique has complete biosynthetic pathways for all 20 amino acids and all but a few cofactors. P. ubique has no pseudogenes, introns, transposons, extrachromosomal elements, or inteins; few paralogs; and the shortest intergenic spacers yet observed for any cell.

The recent application of molecular phylogeny to environmental samples has resulted in the discovery of an abundance of unique and previously unrecognized microorganisms. The vast majority of this microbial diversity has proved refractory to cultivation. Here, we describe a universal method that provides access to this immense reservoir of untapped microbial diversity. This technique combines encapsulation of cells in gel microdroplets for massively parallel microbial cultivation under low nutrient flux conditions, followed by flow cytometry to detect microdroplets containing microcolonies. The ability to grow and study previously uncultured organisms in pure culture will enhance our understanding of microbial physiology and metabolic adaptation and will provide new sources of microbial metabolites. We show that this technology can be applied to samples from several different environments, including seawater and soil.

A thermostable DNA polymerase which possesses an associated 3'-to-5' exonuclease (proofreading) activity has been isolated from the hyperthermophilic archaebacterium, Pyrococcus furiosus (Pfu). To test its fidelity, we have utilized a genetic assay that directly measures DNA polymerase fidelity in vitro during the polymerase chain reaction (PCR). Our results indicate that PCR performed with the DNA polymerase purified from P. furiosus yields amplification products containing less than 10% of the number of mutations obtained from similar amplifications performed with Taq DNA polymerase. The PCR fidelity assay is based on the amplification and cloning of lacI, lacO and lacZα gene sequences (lacIOZα) using either Pfu or Taq DNA polymerase. Certain mutations within the lacI gene inactivate the Lac repressor protein and permit the expression of βGal. When plated on a chromogenic substrate, these LacI− mutants exhibit a blue-plaque phenotype. These studies demonstrate that the error rate per nucleotide induced in the 182 known detectable sites of the lacI gene was 1.6 × 10−6 for Pfu DNA polymerase, a greater than tenfold improvement over the 2.0 × 10−5 error rate for Taq DNA polymerase, after approx. 105-fold amplification.

The hyperthermophile Nanoarchaeum equitans is an obligate symbiont growing in coculture with the crenarchaeon Ignicoccus. Ribosomal protein and rRNA-based phylogenies place its branching point early in the archaeal lineage, representing the new archaeal kingdom Nanoarchaeota. The N. equitans genome (490,885 base pairs) encodes the machinery for information processing and repair, but lacks genes for lipid, cofactor, amino acid, or nucleotide biosyntheses. It is the smallest microbial genome sequenced to date, and also one of the most compact, with 95% of the DNA predicted to encode proteins or stable RNAs. Its limited biosynthetic and catabolic capacity indicates that N. equitans' symbiotic relationship to Ignicoccus is parasitic, making it the only known archaeal parasite. Unlike the small genomes of bacterial parasites that are undergoing reductive evolution, N. equitans has few pseudogenes or extensive regions of noncoding DNA. This organism represents a basal archaeal lineage and has a highly reduced genome.

We have developed a facile procedure for rapid PCR-based site-directed mutagenesis of double-stranded DNA. Increasing the initial template concentration and decreasing the PCR cycles to 5–10 allows us to reduce the rate of undesired second-site mutations and dramatically increase the time savings. Following PCR, DpnI treatment is used to select against parental DNA molecules. The DpnI (target sequence 5'-Gm6ATC) is specific for methylated and hemimethylated DNA and is used to digest parental DNA and select for mutation-containing amplified DNA. DNA isolated from almost all common Escherichia coli strains is Dam methylated and therefore susceptible to DpnI digestion. Pfu DNA polymerase is used, prior to intramolecular ligation of the linear template, to remove any bases extended onto the 3' ends of the PCR product by Taq DNA polymerase. The recircularized vector DNA incorporating the desired mutations is transformed into E. coli. This method can be used independently of any host strain and vector.