CD36 is a platelet membrane glycoprotein whose engagement with oxidized low-density lipoprotein (oxLDL) results in platelet activation. The CD36 gene has been associated with platelet count, platelet volume, as well as lipid levels and CVD risk by genome-wide association studies. Platelet CD36 expression levels have been shown to be associated with both the platelet oxLDL response and an elevated risk of thrombo-embolism. Several genomic variants have been identified as associated with platelet CD36 levels, however none have been conclusively demonstrated to be causative. We screened 81 expression quantitative trait loci (eQTL) single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with platelet CD36 expression by a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) and analyzed the results with a novel Bayesian statistical method. Ten eQTLs located in a 35kb region upstream of the CD36 transcriptional start site demonstrated significant transcription shifts between their minor and major allele in the MPRA assay. Of these, rs2366739 and rs1194196, separated by only 20bp, were confirmed by luciferase assay to alter transcriptional regulation. In addition, electromobility shift assays demonstrated differential DNA:protein complex formation between the two alleles of this locus. Furthermore, deletion of the genomic locus by CRISPR/Cas9 in K562 cells results in upregulation of CD36 transcription. These data indicate that we have identified a variant that regulates expression of CD36, which in turn affects platelet function. To assess the clinical relevance of our findings we used the PhenoScanner tool, which aggregates large scale GWAS findings; the results reinforce the clinical relevance of our variants and the utility of the MPRA assay. The study demonstrates a generalizable paradigm for functional testing of genetic variants to inform mechanistic studies, support patient management and develop precision therapies.

The impermeability of the luminal endothelial cell monolayer is crucial for the normal performance of the vascular and lymphatic systems. A key to this function is the integrity of the monolayer’s intercellular junctions. The known repertoire of junction-regulating genes is incomplete. Current permeability assays are incompatible with high-throughput genome-wide screens that could identify these genes. To overcome these limitations, we designed a new permeability assay that consists of cell monolayers grown on ∼150 μm microcarriers. Each microcarrier functions as a miniature individual assay of permeability (MAP). We demonstrate that false-positive results can be minimized, and that MAP sensitivity to thrombin-induced increase in monolayer permeability is similar to the sensitivity of the measurement of impedance. We validate the assay by showing that the expression of single guide RNAs (sgRNAs) that target genes encoding known thrombin signaling proteins blocks effectively thrombin-induced junction disassembly, and that MAPs carrying such cells can be separated effectively by a fluorescent probe from those that carry cells expressing non-targeting sgRNAs. These results indicate that MAPs are suitable for high-throughput experimentation and for genome-wide screens for genes that mediate the disruptive effect of thrombin on endothelial cell junctions.

NGS studies have uncovered an ever-growing catalog of human variation while leaving an enormous gap between observed variation and experimental characterization of variant function. High-throughput screens powered by NGS have greatly increased the rate of variant functionalization, but the development of comprehensive statistical methods to analyze screen data has lagged behind. In the massively parallel reporter assay (MPRA), short barcodes are counted by sequencing DNA libraries transfected into cells and output RNA in order to simultaneously measure the shifts in transcription induced by thousands of genetic variants. These counts present many statistical challenges, including over-dispersion, depth dependence, and uncertain DNA concentrations. So far, the statistical methods used have been rudimentary, employing transformations on count level data and disregarding experimental and technical structure while failing to quantify uncertainty in the statistical model.