Article15 September 1998free access Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells Minoru Takata Minoru Takata Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Masao S. Sasaki Masao S. Sasaki Radiation Biology Center, Kyoto University, Yoshida Konoe, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Eiichiro Sonoda Eiichiro Sonoda Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Ciaran Morrison Ciaran Morrison Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Mitsumasa Hashimoto Mitsumasa Hashimoto Research Reactor Institute, Kyoto University, Kumatori-cho Noda, Sennan-gun, Osaka, 590-04 Japan Search for more papers by this author Hiroshi Utsumi Hiroshi Utsumi Research Reactor Institute, Kyoto University, Kumatori-cho Noda, Sennan-gun, Osaka, 590-04 Japan Search for more papers by this author Yuko Yamaguchi-Iwai Yuko Yamaguchi-Iwai Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Akira Shinohara Akira Shinohara Department of Biology, Graduate School of Science, Osaka University, Toyonaka, Osaka, 560 Japan Search for more papers by this author Shunichi Takeda Corresponding Author Shunichi Takeda Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Minoru Takata Minoru Takata Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Masao S. Sasaki Masao S. Sasaki Radiation Biology Center, Kyoto University, Yoshida Konoe, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Eiichiro Sonoda Eiichiro Sonoda Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Ciaran Morrison Ciaran Morrison Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Mitsumasa Hashimoto Mitsumasa Hashimoto Research Reactor Institute, Kyoto University, Kumatori-cho Noda, Sennan-gun, Osaka, 590-04 Japan Search for more papers by this author Hiroshi Utsumi Hiroshi Utsumi Research Reactor Institute, Kyoto University, Kumatori-cho Noda, Sennan-gun, Osaka, 590-04 Japan Search for more papers by this author Yuko Yamaguchi-Iwai Yuko Yamaguchi-Iwai Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Akira Shinohara Akira Shinohara Department of Biology, Graduate School of Science, Osaka University, Toyonaka, Osaka, 560 Japan Search for more papers by this author Shunichi Takeda Corresponding Author Shunichi Takeda Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan Search for more papers by this author Author Information Minoru Takata1, Masao S. Sasaki2, Eiichiro Sonoda1, Ciaran Morrison1, Mitsumasa Hashimoto3, Hiroshi Utsumi3, Yuko Yamaguchi-Iwai1, Akira Shinohara4 and Shunichi Takeda 1 1Department of Molecular Immunology and Allergology, Kyoto University Medical School, Konoe Yoshida, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan 2Radiation Biology Center, Kyoto University, Yoshida Konoe, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8315 Japan 3Research Reactor Institute, Kyoto University, Kumatori-cho Noda, Sennan-gun, Osaka, 590-04 Japan 4Department of Biology, Graduate School of Science, Osaka University, Toyonaka, Osaka, 560 Japan *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (1998)17:5497-5508https://doi.org/10.1093/emboj/17.18.5497 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Eukaryotic cells repair DNA double-strand breaks (DSBs) by at least two pathways, homologous recombination (HR) and non-homologous end-joining (NHEJ). Rad54 participates in the first recombinational repair pathway while Ku proteins are involved in NHEJ. To investigate the distinctive as well as redundant roles of these two repair pathways, we analyzed the mutants RAD54−/−, KU70−/− and RAD54−/−/KU70−/−, generated from the chicken B-cell line DT40. We found that the NHEJ pathway plays a dominant role in repairing γ-radiation-induced DSBs during G1–early S phase while recombinational repair is preferentially used in late S–G2 phase. RAD54−/−/KU70−/− cells were profoundly more sensitive to γ-rays than either single mutant, indicating that the two repair pathways are complementary. Spontaneous chromosomal aberrations and cell death were observed in both RAD54−/− and RAD54−/−/KU70−/− cells, with RAD54−/−/KU70−/− cells exhibiting significantly higher levels of chromosomal aberrations than RAD54−/− cells. These observations provide the first genetic evidence that both repair pathways play a role in maintaining chromosomal DNA during the cell cycle. Introduction DNA repair is essential for the successful maintenance and propagation of genetic information. Chromosomal double-strand breaks (DSBs) may occur spontaneously and can be induced by DNA damage. In eukaryotes, two DSB repair pathways have been identified that differ in their requirements for DNA homology. DSB repair by homologous recombination (HR) results in the precise repair of the DNA lesion but requires the presence of homologous sequences elsewhere in the genome (e.g. a homologous chromosome or a sister chromatid). This is the primary mechanism of DSB repair in yeast species. In contrast, it has been speculated that vertebrate cells may appear to favor a non-homologous DNA end-joining (NHEJ) pathway for DSB repair because all DSB-repair defective mutant clones analyzed to date have been found to be defective in NHEJ (Weaver, 1995). The NHEJ pathway joins the two ends of a DSB through a process that is largely independent of terminal DNA sequence homology and that therefore produces junctions that can vary in their sequence composition. The three subunits of DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) (Jeggo, 1997), the XRCC4 gene product (Li et al., 1995) and DNA ligase IV (Critchlow et al., 1997; Grawunder et al., 1997; Wilson et al., 1997) are necessary for the NHEJ pathway. The DNA binding subunit of DNA-PK, Ku, is a heterodimer consisting of 70 and 80 kDa subunits (Ku70 and Ku80, respectively) (Mimori and Hardin, 1986; Mimori et al., 1990; Yaneva et al., 1997). Cells defective in either Ku70 or Ku80 are ionizing-radiation-sensitive and do not complete V(D)J recombination (Smider et al., 1994; Taccioli et al., 1994; Nussenzweig et al., 1996; Zhu et al., 1996; Gu et al., 1997; Ouyang et al., 1997). Saccharomyces cerevisiae contains homologues of the Ku70, Ku80 and ligase IV genes, which also play a role in repairing induced DSBs (Feldmann and Winnacker, 1993; Boulton and Jackson, 1996a,b; Milne et al., 1996; Teo and Jackson, 1997). Studies in S.cerevisiae have defined the RAD52 epistasis group of genes, which is believed to represent a pathway for the repair of DSBs by homologous DNA recombination (Game and Mortimer, 1974; reviewed in Petes et al., 1991; Game, 1993; Shinohara and Ogawa, 1995). Among the known members of the RAD52 group, the RAD51, RAD52 and RAD54 genes are placed in a subgroup because the corresponding mutants possess similar phenotypes; the inactivation of these genes renders S.cerevisiae cells highly sensitive to ionizing radiation and methyl methanesulfonate (MMS), both of which induce DSBs, and strongly reduces spontaneous as well as induced mitotic recombination frequencies (Saeki et al., 1980). Recently, vertebrate homologues of the RAD51, RAD52 and RAD54 genes of S.cerevisiae have been cloned (Bezzubova et al., 1993a,b; Morita et al., 1993; Shinohara et al., 1993; Kanaar et al., 1996). Both chicken B lymphocytes and mouse embryonic stem (ES) cells lacking Rad54 are more sensitive to ionizing radiation than wild-type cells, suggesting that the repair function of the RAD52 epistasis group genes is conserved throughout evolution (Bezzubova et al., 1997; Essers et al., 1997). To study the roles of Rad54-dependent HR repair and Ku-dependent NHEJ pathways, we generated RAD54−/−, KU70−/− and RAD54−/−/KU70−/− clones from the chicken B lymphocyte line DT40 (Baba et al., 1985; Buerstedde et al., 1990). The high level of homologous recombination in DT40 cells (Buerstedde and Takeda, 1991; Takeda et al., 1992; Bezzubova and Buerstedde, 1994) allows the targeted disruption of two genes in a single cell. The remarkably stable phenotype of parental DT40 cells enables us to compare quantitatively the phenotypes of mutant clones of various genes. Since genetic studies in yeast have shown that the HR and NHEJ pathways act independently while having overlapping roles in repairing induced DSBs (Boulton and Jackson, 1996a,b; Milne et al., 1996), we compared the phenotype of RAD54−/−/KU70−/− cells with that of either RAD54−/− or KU70−/− cells. To study the phenotypes of these mutants, we measured the frequencies of spontaneous and γ-radiation-induced cytogenetic aberrations along with survival following γ-radiation. Our data show that the HR and NHEJ pathways are partially complementary with each other in maintaining chromosomal DNA during the cell cycle as well as in repairing DSBs induced by γ-radiation. In addition, while HR is preferentially used at any stage in the cell cycle to repair DSBs in yeast, it does not necessarily function prior to DNA replication in DT40 cells. Results Isolation of the chicken Ku70 cDNA A cDNA fragment encoding a chicken Ku70 homologue was isolated from a chicken intestinal mucosa cDNA library. An open reading frame in the cDNA clone showed ∼70% homology in amino acid sequence to the human Ku70 protein (Feldmann and Winnacker, 1993). An 18 amino acid stretch appears to be appended to the N-terminus in the deduced amino acid sequence of chicken Ku70 (Figure 1, GdKu70); Western blot analysis revealed that chicken Ku70 is slightly larger than human Ku70 (data not shown). Southern blot analysis of chicken genomic DNA showed a single band hybridizing to a chicken Ku cDNA probe (data not shown), indicating that there is a single KU70 gene in the chicken genome. Figure 1.Amino acid sequence comparison between the chicken (GdKu70), human (HsKu70) and murine (MmKu70) Ku70 proteins. Amino acid sequence is shown by the single-letter code. Identical amino acids are shaded. The comparison was made using the Clustal method of the Lasergene Navigator (DNASTAR, Inc., Madison, WI). It should be noted that the chicken KU70 gene (DDBJ/EMBL/GenBank accession No. AB016529) still retains a methionine at the position where the other genes start. The base sequence around this methionine codon is GCCATGG, while that around the initiation codon is GTGATGG. Thus, both ATG sequence contexts are in accordance with the optimal translation initiation consensus determined by Kozak (1986, 1995). Download figure Download PowerPoint KU70 targeting constructs and generation of Ku70-deficient and Rad54/Ku70-doubly deficient DT40 clones A chicken KU70 cDNA probe was used to isolate genomic clones of the KU70 locus, which were partially sequenced to determine the positions of exons. To generate KU70 deletion constructs, either the histidinol (his) or blasticidin (bsr) resistance gene was inserted between sequences of 1.6 and 3.3 kb in length from the KU70 locus as shown in Figure 2A. Targeted integration of these constructs was expected to delete amino acids 66–134, and targeting events were defined by the presence of a 2.8 kb band after Southern blot analysis of EcoRI-digested genomic DNA hybridized to an external probe (Figure 2A and B). Figure 2.Generation of KU70−/− clones. (A) Schematic representation of partial restriction map of the GdKU70 locus, the two gene disruption constructs and the configuration of the targeted loci. Black boxes indicate the positions of exons that were disrupted. Relevant restriction enzyme sites are shown as follows: E, EcoRI; B, BamHI; H, HindIII; Sa, SalI; Xb, XbaI; S, SacI. (B) Southern blot analysis of wild-type (+/+), heterozygous mutant (+/−) and homozygous mutant (−/−) clones. EcoRI-digested genomic DNA was hybridized with the probe DNA shown in (A). (C) Northern blot analysis of total RNA (20 μg/lane) of the indicated genotype after hybridization with a chicken Ku70 cDNA probe. (D) Western blot analysis of chicken Ku70 expression. Cell extracts were separated by SDS–PAGE, and transferred to a filter. Ku70 was visualized by incubation with rabbit anti-chicken Ku70 serum and subsequent binding of a labeled second antibody. Download figure Download PowerPoint The KU70–his construct was transfected into wild-type DT40 cells and drug resistant clones were examined by Southern blot analysis to isolate heterozygous KU70+/− mutant clones. One of the KU70+/− mutant clones was then transfected with the bsr construct to isolate homozygous KU70−/− mutant clones. The disruption of the KU70 gene was verified by Northern and Western blot analyses (Figure 2C and D). To generate RAD54−/−/KU70−/− clones, two RAD54 deletion constructs were sequentially transfected into a KU70−/− clone. The disruption of the RAD54 gene was verified by Northern blot (data not shown), as described previously (Bezzubova et al., 1997). A substantial fraction of RAD54−/− and Rad54−/−/Ku70−/− cells die during the cell cycle The proliferative properties of wild-type, RAD54−/−, KU70−/− and RAD54−/−/KU70−/− clones were monitored by growth curves and by cell-cycle analysis. The number of cells was counted every 24 h, while maintaining the density of cells at an optimal level (105–106 cells/ml) (Figure 3A). Wild-type and KU70−/− cells proliferated at a significantly higher rate than RAD54−/− and RAD54−/−/KU70−/− cells. The plating efficiencies of cells in methylcellulose plates were virtually 100% for wild-type and KU70−/−, ∼80% for RAD54−/− and ∼50% for RAD54−/−/KU70−/− cells. Figure 3.Proliferative characteristics of wild-type, KU70−/−, RAD54−/− and KU70−/−/RAD54−/− cells. (A) Growth curves corresponding to the indicated cell cultures. The genotypes are as displayed at the bottom. Data shown are the average of the results from two separate clones for each genotype. Error bars show the standard deviation of the mean for three experiments. (B) Representative cell-cycle distribution of the indicated cell cultures as measured by BrdU incorporation and DNA-content in flow cytometry analysis. Cells were pulse-labeled for 10 min, and subsequently were stained with FITC-anti-BrdU to detect BrdU incorporation (vertical axis, log scale) and propidium iodide to detect total DNA (horizontal axis, linear scale). The upper gate identifies cells incorporating BrdU (approximately S phase), the lower-left gate identifies G1 cells and the lower-right gate displays G2–M cells. Numbers show the percentages of cells falling in each gate. (C) A representative analysis of the kinetics of progression of wild–type cells through the stages of the cell cycle. S phase cells were labeled using a 10 min pulse of BrdU. The transit of labeled cells through the cell cycle was followed by measuring the percentage of cells in the gate indicated with time after BrdU pulse-labeling (time zero). The relative percentages of cells in the gate were calculated as the percentage of cells falling in the box at each time divided by the percentage of cells falling in the box at time zero ×100 (%). (D) The calculated relative percentages of each type of cells are plotted with time. The symbols for each sample are shown on the right. The progression of BrdU-labeled (i.e. S phase) cells out of S phase, and into first G2–M (4n DNA content), then G1 (2n DNA content), and back into S phase was very similar between the four types of cells and took ∼8 h. Download figure Download PowerPoint Pulse-labeling of asynchronous cells with bromodeoxyuridine (BrdU) showed that the proportion of RAD54−/− and RAD54−/−/KU70−/− cells in G2–M phase was significantly larger than that of wild-type cells: 14.7 ± 2.5% for wild-type, 14.7 ± 2.1% for KU70−/−, 18.3 ± 1.5% for RAD54−/− and 23.0 ± 4.4% for RAD54−/−/KU70−/− cells (Figure 3B). The length of a single cell cycle was measured in a pulse–chase experiment. After a 10 min pulse of BrdU, we followed the progression of BrdU-labeled S phase cells throughout the cell cycle, measured by DNA content analysis (Figure 3C). The progression of the four types of culture out of S phase, and into first G2–M (4n DNA content), and then G1 (2n DNA content), was very similar, a single cell cycle taking ∼8 h (Figure 3D). This conclusion is in agreement with our cell-cycle analyses following synchronization with nocodazole, which synchronizes cells at prometaphase by blocking the assembly of mitotic spindles (Figure 6B). Given that the lengths of a single cell cycle of wild-type, RAD54−/− and RAD54−/−/KU70−/− cells were essentially the same, the lower rates of proliferation of RAD54−/−/KU70−/− and RAD54−/− cell cultures seemed likely to be caused by elevated levels of spontaneous cell death. The fraction of spontaneous cell death of the RAD54−/− clones during a single cell cycle is calculated as 13%, as described in Materials and methods. The fraction of dead cells in the slower-proliferating cell cultures was analyzed using flow cytometry (Figure 4). In flow cytometric analyses, dead cells were expected to be smaller in size and to show bright propidium iodide (PI) staining. In addition, a substantial number of PI dull-positive cells were found in the RAD54−/−/KU70−/− culture. They were annexin-V positive (Martin et al., 1995; Uckun et al., 1996) (Figure 4, upper histogram), suggesting that they were undergoing apoptosis. Thus, we assessed the percentage of dead and dying cells by measuring the cells falling in the PIdull/PIbright gate of the dot plots as shown in Figure 4. This analysis revealed that more dead as well as dying cells were present in RAD54−/−/KU70−/− and RAD54−/− cell cultures than in wild-type, with only a slightly elevated lethality in the absence of Ku70 alone. Figure 4.Spontaneous cell death in RAD54−/− and KU70−/−/RAD54−/− DT40 cells. Representative dot plots display the size (forward scatter) on the x axis (linear scale) and the intensity of PI staining on the y axis (log scale). Numbers indicate the percentages of dying and dead cells, which are PIdull and PIbright. From three separate experiments, the mean percentage and standard deviation of dead and dying cells was 5.9 ± 0.8 for wild-type, 8.7 ± 2.1 for RAD54−/−, 12 ± 3 for RAD54−/− and 22 ± 6.9 for RAD54−/−/KU70−/− cells. PIdull and PI− KU70−/−/RAD54−/− cells were further analyzed by staining with Annexin V as shown in histograms (top, PIdull population; bottom, PI− population). Download figure Download PowerPoint Increased levels of spontaneous chromosomal aberrations in RAD54−/− and RAD54−/−/KU70−/− cells but not in KU70−/− cells The presence of a single unrepaired DSB is sufficient to induce cell death in yeast, as shown by the inducible expression of the HO nuclease in radiation-sensitive yeast mutants (Game, 1993). Given the role of both Rad54- and Ku-dependent pathways in DSB repair, the cell death of RAD54−/− and RAD54−/−/KU70−/− cells suggests that both pathways may repair spontaneously occurring DSBs in chromosomal DNA during the cell cycle. To test this hypothesis, we performed chromosome analysis of metaphase-arrested cells. DT40 cells display a stable karyotype with a modal chromosome number of 80 in total, which comprises 11 autosomal macrochromosomes, the ZW sex chromosomes and 67 microchromosomes (Sonoda et al., 1998). Since alterations in the minichromosomes are difficult to assess, subsequent analysis of chromosome structural aberrations was limited to the 11 autosomal macrochromosomes and the Z chromosome in conventionally Giemsa-stained metaphase cells. Following the screening criteria of ISCN (ISCN1985, 1985), chromosomal aberrations were defined as isochromatid-type when both sister chromatids of a single chromosome were broken at the same locus, while defined as chromatid-type when a single chromatid was broken. KU70−/− and wild-type cells exhibited very few chromosomal aberrations (Table I), in agreement with previous observations (Kemp and Jeggo, 1986; Darroudi and Natarajan, 1987). In marked contrast, RAD54−/− clones frequently displayed chromatid-type breaks. Interestingly, RAD54−/−/KU70−/− cells contained more chromosomal aberrations than RAD54−/− cells, although KU70−/− cells did not exhibit an increased level of chromosomal aberrations. Thus, Rad54-dependent HR may prevent chromosomal aberrations while Ku70 may function as a back-up for the Rad54-dependent pathway in vertebrate cells. The presence of spontaneous chromosomal aberrations in cells defective in DNA repair supports the notion that genomic DNA lesions may occur spontaneously during the cell cycle and that unrepaired DSBs lead to apoptotic cell death of RAD54−/− and RAD54−/−/KU70−/− clones. This observation shows for the first time that NHEJ also can contribute to the maintenance of chromosomal integrity in higher eukaryotic cells. Table 1. Spontaneous chromosomal aberrations Genotype Isochromatid Chromatid Exchangesa Total aberrationsb (per cell ± SEc) Breaksa Gapsa Breaksa Gapsa Wild-type 0.25 0.25 0.25 1.25 0 0.02 ± 0.007 KU70−/− 0 0 0.5 0.5 0 0.01 ± 0.007 RAD54−/− #1 1 1 3 2.7 0 0.077 ± 0.016 RAD54−/− #2 0.33 0.67 3 1 0.67 0.057 ± 0.014 KU70−/−/RAD54−/− 1.7 0.83 4.5 3 0.5 0.11 ± 0.01 Cells were treated with colcemid for 3 h to enrich mitotic cells. The actual number of cells analyzed was 400 for wild-type, 200 for KU70−/−, 300 each for RAD54−/− #1 and #2, and 600 for KU70−/−/RAD54−/− cells. a Data are presented as the number of aberrations per 100 cells. b The total number of chromosomal aberrations. c If the numbers of cells analyzed and total chromosomal aberrations are defined as N and x, respectively, the number of total aberrations per cell ± SE is calculated as x/N ± √x/N, based on the Poisson distribution of spontaneous chromosomal aberrations we observed previously (Sonoda et al., 1998). Synergistic increase in sensitivity to genotoxic damage with mutations in Ku70 and Rad54 The repair capacity of cells defective in Rad54 and/or Ku70 was analyzed in a colony survival assay (Figure 5). RAD54−/− cells were highly sensitive to ionizing irradiation (Figure 5A and C) and MMS (Figure 5D), as previously reported (Bezzubova et al., 1997). RAD54−/−/KU70−/− cells were more sensitive to ionizing radiation and MMS than either single mutant, and expression of either chicken Rad54 or Ku70 in RAD54−/−/KU70−/− cells restored DNA repair activities to those of the respective single mutant levels (Figure 5B). Thus, the two repair pathways may partially complement each other in repairing induced DSBs in DT40 cells. The higher sensitivity of RAD54−/− than KU70−/− cells to ionizing radiation indicates that HR is preferentially used to repair induced DSBs while NHEJ can repair DSBs as a back-up for HR, as has been observed in yeast cells (Winnacker, 1993; Boulton and Jackson, 1996a,b; Feldmann and Milne et al., 1996; Teo and Jackson, 1997). In contrast to previous reports on the effects of the absence of Ku70/80 (Jeggo, 1990; Zdzienicka, 1995; Gu et al., 1997; Ouyang et al., 1997), KU70−/− DT40 cells were somewhat less sensitive to genotoxic treatments than wild-type cells, at higher doses of ionizing radiation and MMS treatments. Figure 5.Graphs displaying the ionizing radiation and the MMS sensitivity of asynchronous clones of the various genotypes indicated. (A and B) The fractions of colonies surviving after γ-radiation compared to non-irradiated controls of the same genotype are shown on the y axis in a logarithmic scale. The radiation doses are displayed on the x axis in a linear scale. (B) RAD54−/−/KU70−/− clones were reconstituted with either chicken RAD54 or KU70 cDNA. Data from a representative clone of each type of the reconstituted cells are shown. (C) The fractions of colonies surviving after X-radiation. (D) The fractions of surviving colonies and the MMS concentrations are displayed on the y and x axes, respectively. The genotypes are as indicated at right bottom. (A, C and D) Data shown are the average of the results from two separate clones of each genotype. Error bars show the standard deviation of the mean for at least three separate experiments. Download figure Download PowerPoint Figure 6.Synchronization of DT40 cells with nocodazole. At each time point following nocodazole treatment, the progression of the cell cycle was analyzed with flow cytometry in the same manner as in Figure 3B. (A) The progression of the cell cycle of wild-type DT40 cells at various time points after nocodazole treatment. (B) The cell cycle of the indicated four types of cells progressed in the same manner, as determined at 5.5 h following synchronization. The progression of the cell cycle was the same among the four types of cells until 17 h after synchronization (data not shown). Download figure Download PowerPoint The recombinational repair pathway functions during late S–G2 phase while the NHEJ pathway is preferentially used during G1–early S phase To further dissect the roles of the two repair pathways, we irradiated synchronized cells and analyzed their sensitivity to γ-radiation at each stage of the cell cycle. Following the treatment of cells with nocodazole for seven hours, most cells accumulated in G2–M phase (Figure 6A). By 9.5 h after the removal of nocodazole, some cells had begun a second round of the cell cycle. After synchronization of RAD54−/− and KU70−/− cells, their cell-cycle progression was indistinguishable from that of wild-type cells (Figure 6B). A substantial number of RAD54−/−/KU70−/− cells were found to die following synchronization. After release from nocodazole treatment, cells were γ-irradiated at various time points and subsequently seeded on methylcellulose plates (Figure 7). The pattern of radiation sensitivity in each stage of the cell cycle was essentially the same in both the first and second round of the cell cycle after synchronization. Consistent with previous reports on cell-cycle and radiation resistance (Jeggo, 1990, 1997), wild-type DT40 cells showed increased radiation resistance in late S–G2 phase relative to G1–early S phase. In contrast to wild-type DT40 cells, RAD54−/− cells did not show increased radiation resistance in late S–G2 phase (Figure 7). This observation implies that the Rad54-dependent recombinational repair pathway may function after a pair of sister chromatids are generated by DNA replication. Such a relatively flat response of radiosensitivity throughout the cell cycle was also observed in a mammalian cell line deficient in Xrcc2, which is a distant homologue of Rad51 and may be involved in recombinational repair (Cheong et al., 1994; Thompson, 1996; Liu et al., 1998). Figure 7.Cell-cycle stage specific sensitivity to γ-radiation. Cells were treated with 2 Gy γ-radiation at the indicated time points following synchronization. The fractions of colonies surviving after irradiation compared with non-irradiated controls of the same genotype are shown. In shaded areas, most cells were in S phase. 4 Gy γ-radiation also exhibited the same pattern of sensitivities during the cell cycle in each of the genotypes (data not shown). Download figure Download PowerPoint KU70−/− cells exhibited a remarkably elevated sensitivity to γ-ray irradiation in G1–early S phase (Figure 7), as observed in mammalian cell lines deficient in the NHEJ pathway (Stamato et al., 1988; Jeggo, 1990; Lee et al., 1997). This elevated sensitivity was also observed in the second round of the cell cycle, although the extent of synchronization is reduced compared with the first round of the cell cycle (Figure 6A). The elevated sensitivity of KU70−/− cells synchronized in G1–early S phase to γ-rays is consistent with the elevated sensitivity of asynchronous KU70−/− cells to lower doses (up to 2 Gy) of ionizing irradiation (Figure 5A and C). To confirm the results obtained from the synchronization with nocodazole, we also employed elutriation to enrich cells at G1 phase (Figure 8A). Following the incubation of the cells at 39.5°C, they underwent a round of the cell cycle in a synchronous manner (Figure 8B). Synchronized cells were subsequently irradiated with X-rays at various time points, and their radiosensitivity was analyzed in the same manner as in Figure 7. The pattern of radiosensitivity of wild-type, RAD54−/− and KU70−/− cells were essentially the same as

Haematopoietic stem cell (HSC) function is known to degrade with age; here, replication stress is shown to be a potent driver of the functional decline of HSCs during physiological ageing in mice due to decreased expression of mini-chromosome maintenance helicase components and reduced activity of the DNA replication machinery. Emmanuelle Passegué and colleagues have studied how haematopoietic stem-cell (HSC) function degrades with age by focusing on the role of DNA damage. They find that replication stress — aberrant replication causing DNA replication forks to slow or stall — is a potent driver of the functional decline of HSCs during physiological ageing. Cell-cycle defects and chromosome gaps or breaks become more frequent, associated with reduced expression of mini-chromosome maintenance helicase components of the DNA replication machinery of old HSCs. Haematopoietic stem cells (HSCs) self-renew for life, thereby making them one of the few blood cells that truly age1,2. Paradoxically, although HSCs numerically expand with age, their functional activity declines over time, resulting in degraded blood production and impaired engraftment following transplantation2. While many drivers of HSC ageing have been proposed2,3,4,5, the reason why HSC function degrades with age remains unknown. Here we show that cycling old HSCs in mice have heightened levels of replication stress associated with cell cycle defects and chromosome gaps or breaks, which are due to decreased expression of mini-chromosome maintenance (MCM) helicase components and altered dynamics of DNA replication forks. Nonetheless, old HSCs survive replication unless confronted with a strong replication challenge, such as transplantation. Moreover, once old HSCs re-establish quiescence, residual replication stress on ribosomal DNA (rDNA) genes leads to the formation of nucleolar-associated γH2AX signals, which persist owing to ineffective H2AX dephosphorylation by mislocalized PP4c phosphatase rather than ongoing DNA damage. Persistent nucleolar γH2AX also acts as a histone modification marking the transcriptional silencing of rDNA genes and decreased ribosome biogenesis in quiescent old HSCs. Our results identify replication stress as a potent driver of functional decline in old HSCs, and highlight the MCM DNA helicase as a potential molecular target for rejuvenation therapies.

Mice lacking the gene encoding poly(ADP-ribosyl) transferase (PARP or ADPRT) display no phenotypic abnormalities, although aged mice are susceptible to epidermal hyperplasia and obesity in a mixed genetic background. Whereas embryonic fibroblasts lacking PARP exhibit normal DNA excision repair, they grow more slowly in vitro. Here we investigated the putative roles of PARP in cell proliferation, cell death, radiosensitivity, and DNA recombination, as well as chromosomal stability. We show that the proliferation deficiency in vitro and in vivo is most likely caused by a hypersensitive response to environmental stress. Although PARP is specifically cleaved during apoptosis, cells lacking this molecule apoptosed normally in response to treatment with anti-Fas, tumor neurosis factor α, γ-irradiation, and dexamethasone, indicating that PARP is dispensable in apoptosis and that PARP−/− thymocytes are not hypersensitive to ionizing radiation. Furthermore, the capacity of mutant cells to carry out immunoglobulin class switching and V(D)J recombination is normal. Finally, primary PARP mutant fibroblasts and splenocytes exhibited an elevated frequency of spontaneous sister chromatid exchanges and elevated micronuclei formation after treatment with genotoxic agents, establishing an important role for PARP in the maintenance of genomic integrity.

Summary

 Most adult stem cells, including hematopoietic stem cells (HSCs), are maintained in a quiescent or resting state in vivo. Quiescence is widely considered to be an essential protective mechanism for stem cells that minimizes endogenous stress caused by cellular respiration and DNA replication. We demonstrate that HSC quiescence can also have detrimental effects. We found that HSCs have unique cell-intrinsic mechanisms ensuring their survival in response to ionizing irradiation (IR), which include enhanced prosurvival gene expression and strong activation of p53-mediated DNA damage response. We show that quiescent and proliferating HSCs are equally radioprotected but use different types of DNA repair mechanisms. We describe how nonhomologous end joining (NHEJ)-mediated DNA repair in quiescent HSCs is associated with acquisition of genomic rearrangements, which can persist in vivo and contribute to hematopoietic abnormalities. Our results demonstrate that quiescence is a double-edged sword that renders HSCs intrinsically vulnerable to mutagenesis following DNA damage.

Sister chromatid exchange (SCE) frequency is a commonly used index of chromosomal stability in response to environmental or genetic mutagens. However, the mechanism generating cytologically detectable SCEs and, therefore, their prognostic value for chromosomal stability in mitotic cells remain unclear. We examined the role of the highly conserved homologous recombination (HR) pathway in SCE by measuring SCE levels in HR-defective vertebrate cells. Spontaneous and mitomycin C-induced SCE levels were significantly reduced for chicken DT40 B cells lacking the key HR genes RAD51 and RAD54 but not for nonhomologous DNA end-joining (NHEJ)-defective KU70(-/-) cells. As measured by targeted integration efficiency, reconstitution of HR activity by expression of a human RAD51 transgene restored SCE levels to normal, confirming that HR is the mechanism responsible for SCE. Our findings show that HR uses the nascent sister chromatid to repair potentially lethal DNA lesions accompanying replication, which might explain the lethality or tumorigenic potential associated with defects in HR or HR-associated proteins.

ABSTRACT Protein degradation at the centrosome, the primary microtubule organizing centre of the cell, is critical to a myriad of cellular processes. Perturbation of the ubiquitin proteasome system causes the formation of an inclusion, or aggresome, at the centrosome. By systematic microscopy analysis, we have placed a subset of centrosomal proteins within the aggresome. Centriolar satellites, proteinaceous granules found in the vicinity of centrosomes, also became incorporated into this structure. Through high-resolution quantitative analysis, we have defined aggresome assembly at the centrosome, demonstrating a requirement for satellites in this process. Furthermore, a module consisting of CP110-CEP97-CEP290 was required to recruit aggresome components early in the pathway and senescent cells were defective in aggresome formation due to limiting amounts of CP110. Finally, satellites and the CP110-CEP97-CEP290 module were required for the aggregation of mutant huntingtin. The accumulation of protein aggregates is central to the pathology of a range of human disorders. These data thereby reveal new roles for CP110, its interactors, and centriolar satellites in controlling cellular proteostasis and the aggregation of disease relevant proteins.