A lambda insertion type cDNA cloning vector, Lambda ZAP, has been constructed. In E. coli a phagemid, pBluescript SK(-), contained within the vector, can be excised by f1 or M13 helper phage. The excision process eliminates the need to subclone DNA inserts from the lambda phage into a plasmid by restriction digestion and ligation. This is possible because Lambda ZAP incorporates the signals for both initiation and termination of DNA synthesis from the f1 bacteriophage origin of replication (1). Six of 21 restriction sites in the excised pBluescript SK polylinker, contained within the NH2-portion of the lacZ gene, are unique in lambda ZAP. Coding sequences inserted into these restriction sites, in the appropriate reading frame, can be expressed from the lacZ promoter as fusion proteins. The features of this vector significantly increase the rate at which clones can be isolated and analyzed. The lambda ZAP vector was tested by the preparation of a chicken liver cDNA library and the isolation of actin clones by screening with oligonucleotide probes. Putative actin clones were excised from the lambda vector and identified by DNA sequencing. The ability of lambda ZAP to serve as a vector for the construction of cDNA expression libraries was determined by detecting fusion proteins from clones containing glucocerbrosidase cDNA's using rabbit IgG anti-glucocerbrosidase antibodies.

Aquifex aeolicus was one of the earliest diverging, and is one of the most thermophilic, bacteria known. It can grow on hydrogen, oxygen, carbon dioxide, and mineral salts. The complex metabolic machinery needed for A. aeolicus to function as a chemolithoautotroph (an organism which uses an inorganic carbon source for biosynthesis and an inorganic chemical energy source) is encoded within a genome that is only one-third the size of the E. coli genome. Metabolic flexibility seems to be reduced as a result of the limited genome size. The use of oxygen (albeit at very low concentrations) as an electron acceptor is allowed by the presence of a complex respiratory apparatus. Although this organism grows at 95 degrees C, the extreme thermal limit of the Bacteria, only a few specific indications of thermophily are apparent from the genome. Here we describe the complete genome sequence of 1,551,335 base pairs of this evolutionarily and physiologically interesting organism.

A thermostable DNA polymerase which possesses an associated 3'-to-5' exonuclease (proofreading) activity has been isolated from the hyperthermophilic archaebacterium, Pyrococcus furiosus (Pfu). To test its fidelity, we have utilized a genetic assay that directly measures DNA polymerase fidelity in vitro during the polymerase chain reaction (PCR). Our results indicate that PCR performed with the DNA polymerase purified from P. furiosus yields amplification products containing less than 10% of the number of mutations obtained from similar amplifications performed with Taq DNA polymerase. The PCR fidelity assay is based on the amplification and cloning of lacI, lacO and lacZα gene sequences (lacIOZα) using either Pfu or Taq DNA polymerase. Certain mutations within the lacI gene inactivate the Lac repressor protein and permit the expression of βGal. When plated on a chromogenic substrate, these LacI− mutants exhibit a blue-plaque phenotype. These studies demonstrate that the error rate per nucleotide induced in the 182 known detectable sites of the lacI gene was 1.6 × 10−6 for Pfu DNA polymerase, a greater than tenfold improvement over the 2.0 × 10−5 error rate for Taq DNA polymerase, after approx. 105-fold amplification.

The hyperthermophile Nanoarchaeum equitans is an obligate symbiont growing in coculture with the crenarchaeon Ignicoccus. Ribosomal protein and rRNA-based phylogenies place its branching point early in the archaeal lineage, representing the new archaeal kingdom Nanoarchaeota. The N. equitans genome (490,885 base pairs) encodes the machinery for information processing and repair, but lacks genes for lipid, cofactor, amino acid, or nucleotide biosyntheses. It is the smallest microbial genome sequenced to date, and also one of the most compact, with 95% of the DNA predicted to encode proteins or stable RNAs. Its limited biosynthetic and catabolic capacity indicates that N. equitans' symbiotic relationship to Ignicoccus is parasitic, making it the only known archaeal parasite. Unlike the small genomes of bacterial parasites that are undergoing reductive evolution, N. equitans has few pseudogenes or extensive regions of noncoding DNA. This organism represents a basal archaeal lineage and has a highly reduced genome.