A lambda insertion type cDNA cloning vector, Lambda ZAP, has been constructed. In E. coli a phagemid, pBluescript SK(-), contained within the vector, can be excised by f1 or M13 helper phage. The excision process eliminates the need to subclone DNA inserts from the lambda phage into a plasmid by restriction digestion and ligation. This is possible because Lambda ZAP incorporates the signals for both initiation and termination of DNA synthesis from the f1 bacteriophage origin of replication (1). Six of 21 restriction sites in the excised pBluescript SK polylinker, contained within the NH2-portion of the lacZ gene, are unique in lambda ZAP. Coding sequences inserted into these restriction sites, in the appropriate reading frame, can be expressed from the lacZ promoter as fusion proteins. The features of this vector significantly increase the rate at which clones can be isolated and analyzed. The lambda ZAP vector was tested by the preparation of a chicken liver cDNA library and the isolation of actin clones by screening with oligonucleotide probes. Putative actin clones were excised from the lambda vector and identified by DNA sequencing. The ability of lambda ZAP to serve as a vector for the construction of cDNA expression libraries was determined by detecting fusion proteins from clones containing glucocerbrosidase cDNA's using rabbit IgG anti-glucocerbrosidase antibodies.

A thermostable DNA polymerase which possesses an associated 3'-to-5' exonuclease (proofreading) activity has been isolated from the hyperthermophilic archaebacterium, Pyrococcus furiosus (Pfu). To test its fidelity, we have utilized a genetic assay that directly measures DNA polymerase fidelity in vitro during the polymerase chain reaction (PCR). Our results indicate that PCR performed with the DNA polymerase purified from P. furiosus yields amplification products containing less than 10% of the number of mutations obtained from similar amplifications performed with Taq DNA polymerase. The PCR fidelity assay is based on the amplification and cloning of lacI, lacO and lacZα gene sequences (lacIOZα) using either Pfu or Taq DNA polymerase. Certain mutations within the lacI gene inactivate the Lac repressor protein and permit the expression of βGal. When plated on a chromogenic substrate, these LacI− mutants exhibit a blue-plaque phenotype. These studies demonstrate that the error rate per nucleotide induced in the 182 known detectable sites of the lacI gene was 1.6 × 10−6 for Pfu DNA polymerase, a greater than tenfold improvement over the 2.0 × 10−5 error rate for Taq DNA polymerase, after approx. 105-fold amplification.

Transgenic mice with a lambda shuttle vector containing a lacI target gene were generated for use as a short-term, in vivo mutagenesis assay. The gene is recovered from the treated mice by exposing mouse genomic DNA to in vitro packaging extracts and plating the rescued phage on agar plates containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactopyranoside (X-Gal). Phage with mutations in the lacI gene form blue plaques, whereas phage with a nonmutated lacI form colorless plaques. Spontaneous background mutant rates using this system range from 0.6 x 10(-5) to 1.7 x 10(-5), depending upon tissue analyzed, with germ cells exhibiting less than one-third the background rate of somatic tissue. Treatment of the mice with N-ethyl-N-nitrosourea (EtNU), benzo[a]pyrene (B[a]P), or cyclophosphamide caused an induction of mutations over background. Recovery of the lacI target for sequence analysis was performed by genetic excision of a plasmid from the phage using partial filamentous phage origins. The predominant mutations identified from untreated and treated populations were base substitutions. Although it has been shown by others that 70% of all spontaneous mutations within the lacI gene, when replicated in Escherichia coli, occur at a hot spot located at bases 620-632, only 1 of 21 spontaneous mutations has been identified in this region in the transgenic mouse system. In addition, 5 of 9 spontaneous transitions analyzed occur at CpG dinucleotides, whereas no transition mutations were identified at the prokaryotic deamination hot spots occurring at dcm sites (CCA/TGG) within the lacI gene. For EtNU, approximately equal amounts of transitions and transversions were observed, contrasting with B[a]P-induced mutations, in which only transversions were obtained. In addition, B[a]P mutagenesis showed a predominance of mutations (81%) involving cytosines and/or guanines, consistent with its known mode of action. The discovery of a spontaneous mutation spectrum different from that of bacterial assays, coupled with the concordance of EtNU and B[a]P base mutations with the known mechanisms of activity for these mutagens, suggests that this transgenic system will be useful as a short-term, in vivo system for mutagen assessment and analysis of mechanisms leading to mutations.