Mutation of Caspase 9 (Casp9) results in embryonic lethality and defective brain development associated with decreased apoptosis. Casp9 −/− embryonic stem cells and embryonic fibroblasts are resistant to several apoptotic stimuli, including UV and γ irradiation. Casp9−/− thymocytes are also resistant to dexamethasone- and γ irradiation–induced apoptosis, but are surprisingly sensitive to apoptosis induced by UV irradiation or anti-CD95. Resistance to apoptosis is accompanied by retention of the mitochondrial membrane potential in mutant cells. In addition, cytochrome c is translocated to the cytosol of Casp9−/− ES cells upon UV stimulation, suggesting that Casp9 acts downstream of cytochrome c. Caspase processing is inhibited in Casp9−/− ES cells but not in thymocytes or splenocytes. Comparison of the requirement for Casp9 and Casp3 in different apoptotic settings indicates the existence of at least four different apoptotic pathways in mammalian cells.

We have generated RANK (receptor activator of NF-kappaB) nullizygous mice to determine the molecular genetic interactions between osteoprotegerin, osteoprotegerin ligand, and RANK during bone resorption and remodeling processes. RANK(-/-) mice lack osteoclasts and have a profound defect in bone resorption and remodeling and in the development of the cartilaginous growth plates of endochondral bone. The osteopetrosis observed in these mice can be reversed by transplantation of bone marrow from rag1(-/-) (recombinase activating gene 1) mice, indicating that RANK(-/-) mice have an intrinsic defect in osteoclast function. Calciotropic hormones and proresorptive cytokines that are known to induce bone resorption in mice and human were administered to RANK(-/-) mice without inducing hypercalcemia, although tumor necrosis factor alpha treatment leads to the rare appearance of osteoclast-like cells near the site of injection. Osteoclastogenesis can be initiated in RANK(-/-) mice by transfer of the RANK cDNA back into hematopoietic precursors, suggesting a means to critically evaluate RANK structural features required for bone resorption. Together these data indicate that RANK is the intrinsic cell surface determinant that mediates osteoprotegerin ligand effects on bone resorption and remodeling as well as the physiological and pathological effects of calciotropic hormones and proresorptive cytokines.

Minna Woo, Razqallah Hakem, Maria S. Soengas, Gordon S. Duncan, Arda Shahinian, David Kägi, Anne Hakem, Mila McCurrach, Wilson Khoo, Stephen A. Kaufman, Giorgio Senaldi, Tamara Howard, Scott W. Lowe, and Tak W. Mak Amgen Institute Ontario Cancer Institute, Department of Medical Biophysics and Immunology, University of Toronto, Toronto, Ontario M5G2C1, Canada; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 11724 USA; Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA 91320-1789 USA

Osteoprotegerin (OPG) and OPG-ligand (OPGL) potently inhibit and stimulate, respectively, osteoclast differentiation (Simonet, W.S., D.L. Lacey, C.R. Dunstan, M. Kelley, M.-S. Chang, R. Luethy, H.Q. Nguyen, S. Wooden, L. Bennett, T. Boone, et al. 1997. Cell. 89:309-319; Lacey, D.L., E. Timms, H.-L. Tan, M.J. Kelley, C.R. Dunstan, T. Burgess, R. Elliott, A. Colombero, G. Elliott, S. Scully, et al. 1998. Cell. 93: 165-176), but their effects on mature osteoclasts are not well understood. Using primary cultures of rat osteoclasts on bone slices, we find that OPGL causes approximately sevenfold increase in total bone surface erosion. By scanning electron microscopy, OPGL-treated osteoclasts generate more clusters of lacunae on bone suggesting that multiple, spatially associated cycles of resorption have occurred. However, the size of individual resorption events are unchanged by OPGL treatment. Mechanistically, OPGL binds specifically to mature OCs and rapidly (within 30 min) induces actin ring formation; a marked cytoskeletal rearrangement that necessarily precedes bone resorption. Furthermore, we show that antibodies raised against the OPGL receptor, RANK, also induce actin ring formation. OPGL-treated mice exhibit increases in blood ionized Ca++ within 1 h after injections, consistent with immediate OC activation in vivo. Finally, we find that OPG blocks OPGL's effects on both actin ring formation and bone resorption. Together, these findings indicate that, in addition to their effects on OC precursors, OPGL and OPG have profound and direct effects on mature OCs and indicate that the OC receptor, RANK, mediates OPGL's effects.

Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder that is pathologically characterized by the presence of intracytoplasmic Lewy bodies, the major component of which are filaments consisting of α-synuclein. Two recently identified point mutations in α-synuclein are the only known genetic causes of PD, but their pathogenic mechanism is not understood. Here we show that both wild type and mutant α-synuclein form insoluble fibrillar aggregates with antiparallel β-sheet structure upon incubation at physiological temperature in vitro. Importantly, aggregate formation is accelerated by both PD-linked mutations. Under the experimental conditions, the lag time for the formation of precipitable aggregates is about 280 h for the wild type protein, 180 h for the A30P mutant, and only 100 h for the A53T mutant protein. These data suggest that the formation of α-synuclein aggregates could be a critical step in PD pathogenesis, which is accelerated by the PD-linked mutations.

Angiopoietin-2 (Ang2) exhibits broad expression in the remodeling vasculature of human tumors but very limited expression in normal tissues, making it an attractive candidate target for antiangiogenic cancer therapy. To investigate the functional consequences of blocking Ang2 activity, we generated antibodies and peptide-Fc fusion proteins that potently and selectively neutralize the interaction between Ang2 and its receptor, Tie2. Systemic treatment of tumor-bearing mice with these Ang2-blocking agents resulted in tumor stasis, followed by elimination of all measurable tumor in a subset of animals. These effects were accompanied by reduced endothelial cell proliferation, consistent with an antiangiogenic therapeutic mechanism. Anti-Ang2 therapy also prevented VEGF-stimulated neovascularization in a rat corneal model of angiogenesis. These results imply that specific Ang2 inhibition may represent an effective antiangiogenic strategy for treating patients with solid tumors.