Transcriptional repression by Mad–Max heterodimers requires interaction of Mad with the corepressors mSin3A/B. Sin3p, the S. cerevisiae homolog of mSin3, functions in the same pathway as Rpd3p, a protein related to two recently identified mammalian histone deacetylases, HDAC1 and HDAC2. Here, we demonstrate that mSin3A and HDAC1/2 are associated in vivo. HDAC2 binding requires a conserved region of mSin3A capable of mediating transcriptional repression. In addition, Mad1 forms a complex with mSin3 and HDAC2 that contains histone deacetylase activity. Trichostatin A, an inhibitor of histone deacetylases, abolishes Mad repression. We propose that Mad–Max functions by recruiting the mSin3–HDAC corepressor complex that deacetylates nucleosomal histones, producing alterations in chromatin structure that block transcription.

YY1 is a mammalian zinc-finger transcription factor with unusual structural and functional features. It has been implicated as a positive and a negative regulatory factor that binds to the CCATNTT consensus DNA element located in promoters of many cellular and viral genes. A mammalian cDNA that encodes a YY1-binding protein and possesses sequence homology with the yeast transcriptional factor RPD3 has been identified. A Gal4 DNA binding domain–mammalian RPD3 fusion protein strongly represses transcription from a promoter containing Gal4 binding sites. Association between YY1 and mammalian RPD3 requires a glycine-rich region on YY1. Mutations in this region abolish the interaction with mammalian RPD3 and eliminate transcriptional repression by YY1. These data suggest that YY1 negatively regulates transcription by tethering RPD3 to DNA as a cofactor and that this transcriptional mechanism is highly conserved from yeast to human.

Several human cDNAs encoding a histone deacetylase protein, HDAC3, have been isolated. Analysis of the predicted amino acid sequence of HDAC3 revealed an open reading frame of 428 amino acids with a predicted molecular mass of 49 kDa. The HDAC3 protein is 50% identical in DNA sequence and 53% identical in protein sequence compared with the previously cloned human HDAC1. Comparison of the HDAC3 sequence with human HDAC2 also yielded similar results, with 51% identity in DNA sequence and 52% identity in protein sequence. The expressed HDAC3 protein is functionally active because it possesses histone deacetylase activity, represses transcription when tethered to a promoter, and binds transcription factor YY1. Similar to HDAC1 and HDAC2, HDAC3 is ubiquitously expressed in many different cell types. Several human cDNAs encoding a histone deacetylase protein, HDAC3, have been isolated. Analysis of the predicted amino acid sequence of HDAC3 revealed an open reading frame of 428 amino acids with a predicted molecular mass of 49 kDa. The HDAC3 protein is 50% identical in DNA sequence and 53% identical in protein sequence compared with the previously cloned human HDAC1. Comparison of the HDAC3 sequence with human HDAC2 also yielded similar results, with 51% identity in DNA sequence and 52% identity in protein sequence. The expressed HDAC3 protein is functionally active because it possesses histone deacetylase activity, represses transcription when tethered to a promoter, and binds transcription factor YY1. Similar to HDAC1 and HDAC2, HDAC3 is ubiquitously expressed in many different cell types. The organization of chromatin structure is a fundamental and significant component of transcriptional regulation in all eukaryotic cells. Transcriptionally active or repressed chromatin is determined, at least in part, by the modification of histones. For example, hyperacetylation of histones generally leads to an increase in transcription, whereas hypoacetylation of histones appears to have the opposite effect (reviewed in Refs. 1Brownell J.E. Allis C.D. Curr. Opin. Genet. Dev. 1996; 6: 176-184Crossref PubMed Scopus (463) Google Scholar, 2Wolffe A.P. Science. 1996; 272: 371-372Crossref PubMed Scopus (271) Google Scholar, 3Wade P.A. Wolffe A.P. Curr. Biol. 1997; 7: R82-R84Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 4Davie J.R. J. Cell. Biochem. 1996; 62: 149-157Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar). Nuclear histone acetyltransferases such as transcription factors GCN5, PCAF, p300/CBP, and TAFII230/250 have been identified from different organisms (5Brownell J.E. Zhou J. Ranalli T. Kobayashi R. Edmondson D.G. Roth S.Y. Allis C.D. Cell. 1996; 84: 843-851Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1277) Google Scholar, 6Mizzen C.A. Yang X.-J. Kokubo T. Brownell J.E. Bannister A.J. Owen-Hughes T. Workman J. Wang L. Berger S.L. Kouzarides T. Nakatani Y. Allis C.D. Cell. 1996; 87: 1261-1270Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (617) Google Scholar, 7Bannister A.J. Kouzarides T. Nature. 1996; 384: 641-643Crossref PubMed Scopus (1523) Google Scholar, 8Ogryzko V.V. Schiltz R.L. Russanova V. Howard B.H. Nakatani Y. Cell. 1996; 87: 953-959Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2368) Google Scholar, 9Kuo M.H. Brownell J.E. Sobel R.E. Ranalli T.A. Cook R.G. Edmondson D.G. Roth S.Y. Allis C.D. Nature. 1996; 383: 269-272Crossref PubMed Scopus (503) Google Scholar).Several yeast and mammalian histone deacetylases have been identified, and their corresponding genes have been cloned (10Taunton J. Hassig C.A. Schreiber S.L. Science. 1996; 272: 408-411Crossref PubMed Scopus (1524) Google Scholar, 11Yang W.-M. Inouye C. Zeng Y. Bearss D. Seto E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 12845-12850Crossref PubMed Scopus (482) Google Scholar, 12Rundlett S. Carmen A.A. Kobayashi R. Bavykin S. Turner B.M. Grunstein M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14503-14508Crossref PubMed Scopus (516) Google Scholar). In yeast, the HDA1 protein, which shares sequence similarity to RPD3, is a subunit of a large histone deacetylase complex HDA. RPD3 is also associated with another yeast histone deacetylase complex HDB. Using a trapoxin (an inhibitor of histone deacetylase) affinity matrix, Taunton et al. (10Taunton J. Hassig C.A. Schreiber S.L. Science. 1996; 272: 408-411Crossref PubMed Scopus (1524) Google Scholar) purified and cloned a human 55-kDa protein related to the yeast protein RPD3. Immunoprecipitation of this 55-kDa protein, HDAC1 (also called HD1), showed that it contains histone deacetylase activity. A second human histone deacetylase protein, HDAC2, with high homology to yeast RPD3 was identified based on a yeast two-hybrid trap experiment with the YY1 transcription factor as a bait (11Yang W.-M. Inouye C. Zeng Y. Bearss D. Seto E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 12845-12850Crossref PubMed Scopus (482) Google Scholar). YY1 negatively regulates transcription by tethering HDAC2 to DNA as a corepressor. Both HDAC1 and HDAC2 exist in a complex with the corepressor mSIN3 and mediate Mad transcriptional repression (13Hassig C.A. Fleischer T.C. Billin A.N. Schreiber S.L. Ayer D.E. Cell. 1997; 89: 341-347Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (656) Google Scholar, 14Laherty C.D. Yang W.-M. Sun J.-M. Davie J.R. Seto E. Eisenman R.N. Cell. 1997; 89: 349-356Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (837) Google Scholar, 15Zhang Y. Iratni R. Erdjument-Bromage H. Tempst P. Reinberg D. Cell. 1997; 89: 357-364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (498) Google Scholar). In addition, HDAC1 and HDAC2 are essential components of two thyroid hormone receptor corepressors, N-CoR and SMRT (16Heinzel T. Lavinsky R.M. Mullen T.-M. Soderstrom M. Laherty C.D. Torchia J. Yang W.M. Brard G. Ngo S.D. Davie J.R. Seto E. Eisenman R.N. Rose D.W. Glass C.K. Rosenfeld M.G. Nature. 1997; 387: 43-48Crossref PubMed Scopus (1079) Google Scholar, 17Alland L. Muhle R. Hou H. Potes J. Chin L. Schreiber-Agus N. DePinho R.A. Nature. 1997; 387: 49-55Crossref PubMed Scopus (733) Google Scholar, 18Nagy L. Kao H.Y. Chakravarti D. Lin R.J. Hassig C.A. Ayer D.E. Schreiber S.L. Evans R.M. Cell. 1997; 89: 373-380Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1101) Google Scholar). HDAC1 is also an important factor that represses transactivation by progesterone receptor (19Jenster G. Spencer T.E. Burcin M.M. Tsai S.Y. Tsai M.-J. O'Malley B.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 7879-7884Crossref PubMed Scopus (231) Google Scholar).The yeast RPD3 protein was originally identified in genetic screens for transcriptional repressors (20Vidal M. Gaber R.F. Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 6317-6327Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar). Besides human and mouse, highly homologous yeast RPD3 sequences have been identified inDrosophila (21Rubertis F.D. Kadosh D. Henchoz S. Pauli D. Reuter G. Struhl K. Spierer P. Nature. 1996; 384: 589-591Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar), Caenorhabditis elegans (X78454 and 1176665), and Xenopus laevis (gi:576995). Currently, it has not yet been established whether the C. elegans orX. laevis RPD3-related proteins have histone deacetylase activities or whether they play a role in transcriptional repression. Here, we describe the identification of a third human RPD3-related protein, HDAC3, that contains histone deacetylase activity. Like HDAC1 and HDAC2, HDAC3 represses transcription and binds transcription factor YY1, suggesting that it may participate in a large complex that mediates a wide variety of repression systems in human. The organization of chromatin structure is a fundamental and significant component of transcriptional regulation in all eukaryotic cells. Transcriptionally active or repressed chromatin is determined, at least in part, by the modification of histones. For example, hyperacetylation of histones generally leads to an increase in transcription, whereas hypoacetylation of histones appears to have the opposite effect (reviewed in Refs. 1Brownell J.E. Allis C.D. Curr. Opin. Genet. Dev. 1996; 6: 176-184Crossref PubMed Scopus (463) Google Scholar, 2Wolffe A.P. Science. 1996; 272: 371-372Crossref PubMed Scopus (271) Google Scholar, 3Wade P.A. Wolffe A.P. Curr. Biol. 1997; 7: R82-R84Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 4Davie J.R. J. Cell. Biochem. 1996; 62: 149-157Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar). Nuclear histone acetyltransferases such as transcription factors GCN5, PCAF, p300/CBP, and TAFII230/250 have been identified from different organisms (5Brownell J.E. Zhou J. Ranalli T. Kobayashi R. Edmondson D.G. Roth S.Y. Allis C.D. Cell. 1996; 84: 843-851Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1277) Google Scholar, 6Mizzen C.A. Yang X.-J. Kokubo T. Brownell J.E. Bannister A.J. Owen-Hughes T. Workman J. Wang L. Berger S.L. Kouzarides T. Nakatani Y. Allis C.D. Cell. 1996; 87: 1261-1270Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (617) Google Scholar, 7Bannister A.J. Kouzarides T. Nature. 1996; 384: 641-643Crossref PubMed Scopus (1523) Google Scholar, 8Ogryzko V.V. Schiltz R.L. Russanova V. Howard B.H. Nakatani Y. Cell. 1996; 87: 953-959Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2368) Google Scholar, 9Kuo M.H. Brownell J.E. Sobel R.E. Ranalli T.A. Cook R.G. Edmondson D.G. Roth S.Y. Allis C.D. Nature. 1996; 383: 269-272Crossref PubMed Scopus (503) Google Scholar). Several yeast and mammalian histone deacetylases have been identified, and their corresponding genes have been cloned (10Taunton J. Hassig C.A. Schreiber S.L. Science. 1996; 272: 408-411Crossref PubMed Scopus (1524) Google Scholar, 11Yang W.-M. Inouye C. Zeng Y. Bearss D. Seto E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 12845-12850Crossref PubMed Scopus (482) Google Scholar, 12Rundlett S. Carmen A.A. Kobayashi R. Bavykin S. Turner B.M. Grunstein M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14503-14508Crossref PubMed Scopus (516) Google Scholar). In yeast, the HDA1 protein, which shares sequence similarity to RPD3, is a subunit of a large histone deacetylase complex HDA. RPD3 is also associated with another yeast histone deacetylase complex HDB. Using a trapoxin (an inhibitor of histone deacetylase) affinity matrix, Taunton et al. (10Taunton J. Hassig C.A. Schreiber S.L. Science. 1996; 272: 408-411Crossref PubMed Scopus (1524) Google Scholar) purified and cloned a human 55-kDa protein related to the yeast protein RPD3. Immunoprecipitation of this 55-kDa protein, HDAC1 (also called HD1), showed that it contains histone deacetylase activity. A second human histone deacetylase protein, HDAC2, with high homology to yeast RPD3 was identified based on a yeast two-hybrid trap experiment with the YY1 transcription factor as a bait (11Yang W.-M. Inouye C. Zeng Y. Bearss D. Seto E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 12845-12850Crossref PubMed Scopus (482) Google Scholar). YY1 negatively regulates transcription by tethering HDAC2 to DNA as a corepressor. Both HDAC1 and HDAC2 exist in a complex with the corepressor mSIN3 and mediate Mad transcriptional repression (13Hassig C.A. Fleischer T.C. Billin A.N. Schreiber S.L. Ayer D.E. Cell. 1997; 89: 341-347Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (656) Google Scholar, 14Laherty C.D. Yang W.-M. Sun J.-M. Davie J.R. Seto E. Eisenman R.N. Cell. 1997; 89: 349-356Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (837) Google Scholar, 15Zhang Y. Iratni R. Erdjument-Bromage H. Tempst P. Reinberg D. Cell. 1997; 89: 357-364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (498) Google Scholar). In addition, HDAC1 and HDAC2 are essential components of two thyroid hormone receptor corepressors, N-CoR and SMRT (16Heinzel T. Lavinsky R.M. Mullen T.-M. Soderstrom M. Laherty C.D. Torchia J. Yang W.M. Brard G. Ngo S.D. Davie J.R. Seto E. Eisenman R.N. Rose D.W. Glass C.K. Rosenfeld M.G. Nature. 1997; 387: 43-48Crossref PubMed Scopus (1079) Google Scholar, 17Alland L. Muhle R. Hou H. Potes J. Chin L. Schreiber-Agus N. DePinho R.A. Nature. 1997; 387: 49-55Crossref PubMed Scopus (733) Google Scholar, 18Nagy L. Kao H.Y. Chakravarti D. Lin R.J. Hassig C.A. Ayer D.E. Schreiber S.L. Evans R.M. Cell. 1997; 89: 373-380Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1101) Google Scholar). HDAC1 is also an important factor that represses transactivation by progesterone receptor (19Jenster G. Spencer T.E. Burcin M.M. Tsai S.Y. Tsai M.-J. O'Malley B.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 7879-7884Crossref PubMed Scopus (231) Google Scholar). The yeast RPD3 protein was originally identified in genetic screens for transcriptional repressors (20Vidal M. Gaber R.F. Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 6317-6327Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar). Besides human and mouse, highly homologous yeast RPD3 sequences have been identified inDrosophila (21Rubertis F.D. Kadosh D. Henchoz S. Pauli D. Reuter G. Struhl K. Spierer P. Nature. 1996; 384: 589-591Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar), Caenorhabditis elegans (X78454 and 1176665), and Xenopus laevis (gi:576995). Currently, it has not yet been established whether the C. elegans orX. laevis RPD3-related proteins have histone deacetylase activities or whether they play a role in transcriptional repression. Here, we describe the identification of a third human RPD3-related protein, HDAC3, that contains histone deacetylase activity. Like HDAC1 and HDAC2, HDAC3 represses transcription and binds transcription factor YY1, suggesting that it may participate in a large complex that mediates a wide variety of repression systems in human. We thank Mon-Li Chu, Chris Hassig, Wen-Hwa Lee, Ivan Sadowski, Stuart Schreiber, Yang Shi, and Xueliang Zhu for generous gifts of plasmids and libraries and Nancy Olashaw and Tere Munoz-Antonia for discussion and critical reading of the manuscript.

p53, the most commonly mutated gene in cancer cells, directs cell cycle arrest or induces programmed cell death (apoptosis) in response to stress. It has been demonstrated that p53 activity is up-regulated in part by posttranslational acetylation. In agreement with these observations, here we show that mammalian histone deacetylase (HDAC)-1, -2, and -3 are all capable of down-regulating p53 function. Down-regulation of p53 activity by HDACs is HDAC dosage-dependent, requires the deacetylase activity of HDACs, and depends on the region of p53 that is acetylated by p300/CREB-binding protein (CBP). These results suggest that interactions of p53 and HDACs likely result in p53 deacetylation, thereby reducing its transcriptional activity. In support of this idea, GST pull-down and immunoprecipitation assays show that p53 interacts with HDAC1 both in vitro and in vivo. Furthermore, a pre-acetylated p53 peptide was significantly deacetylated by immunoprecipitated wild type HDAC1 but not deacetylase mutant. Also, co-expression of HDAC1 greatly reduced the in vivo acetylation level of p53. Finally, we report that the activation potential of p53 on the BAX promoter, a natural p53-responsive system, is reduced in the presence of HDACs. Taken together, our findings indicate that deacetylation of p53 by histone deacetylases is likely to be part of the mechanisms that control the physiological activity of p53. p53, the most commonly mutated gene in cancer cells, directs cell cycle arrest or induces programmed cell death (apoptosis) in response to stress. It has been demonstrated that p53 activity is up-regulated in part by posttranslational acetylation. In agreement with these observations, here we show that mammalian histone deacetylase (HDAC)-1, -2, and -3 are all capable of down-regulating p53 function. Down-regulation of p53 activity by HDACs is HDAC dosage-dependent, requires the deacetylase activity of HDACs, and depends on the region of p53 that is acetylated by p300/CREB-binding protein (CBP). These results suggest that interactions of p53 and HDACs likely result in p53 deacetylation, thereby reducing its transcriptional activity. In support of this idea, GST pull-down and immunoprecipitation assays show that p53 interacts with HDAC1 both in vitro and in vivo. Furthermore, a pre-acetylated p53 peptide was significantly deacetylated by immunoprecipitated wild type HDAC1 but not deacetylase mutant. Also, co-expression of HDAC1 greatly reduced the in vivo acetylation level of p53. Finally, we report that the activation potential of p53 on the BAX promoter, a natural p53-responsive system, is reduced in the presence of HDACs. Taken together, our findings indicate that deacetylation of p53 by histone deacetylases is likely to be part of the mechanisms that control the physiological activity of p53. CREB-binding protein histone deacetylase glutathioneS-transferase antibody chloramphenicol acetyltransferase p53-responsive elements benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate p53, a critical regulator of cell proliferation, transmits signals to genes that control the cell cycle and apoptosis (or programmed cell death) when cells are under stress (1.Oren M. J. Biol. Chem. 1999; 274: 36031-36034Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (494) Google Scholar, 2.Sionov R.V. Haupt Y. Oncogene. 1999; 18: 6145-6157Crossref PubMed Scopus (508) Google Scholar). These functions are principally controlled by the ability of p53 to bind to DNA with sequence specificity and activate transcription. Inactivation of this property of p53, mostly by mutations that occurred in the central DNA-binding domain, often leads to malignancy. Several distinct functional domains within p53 have been characterized (3.Ko L.J. Prives C. Genes Dev. 1996; 10: 1054-1072Crossref PubMed Scopus (2301) Google Scholar) as follows: an N-terminal domain that harbors transactivation activity (amino acids 1–43), a central DNA-binding domain that recognizes specific DNA sequences (amino acids 100–300), and the C-terminal region that includes a tetramerization domain (amino acids 320–360) as well as a regulatory domain (amino acids 363–393). Posttranslational modifications of the extreme C-terminal 30 residues have been shown to play a very important role in the regulation of p53-specific DNA binding. For example, phosphorylation, antibody binding, deletion, or recently identified acetylation of this region can convert p53 from a latent to an active form for DNA binding. A model for allosteric regulation of p53 was proposed in which the sequence-specific DNA binding activity of p53 is negatively regulated by its inhibitory C-terminal domain. Upon exposure to stress, posttranslational modifications described above relieve this inhibition (4.Gu W. Roeder R.G. Cell. 1997; 90: 595-606Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2212) Google Scholar). Recruitment of p300/CBP,1 a co-activator with putative histone acetyltransferase activity (5.Bannister A.J. Kouzarides T. Nature. 1996; 384: 641-643Crossref PubMed Scopus (1549) Google Scholar, 6.Ogryzko V.V. Schiltz R.L. Russanova V. Howard B.H. Nakatani Y. Cell. 1996; 87: 953-959Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2448) Google Scholar), by p53 is believed to result in the synergistic enhancement of p53 transactivation activity by at least two different pathways, core histone acetylation and p53 acetylation. Hyperacetylation of histones correlates with enhanced transcription, presumably by increasing the accessibility of transcription factors to nucleosomal DNA (7.Workman J.L. Kingston R.E. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 545-579Crossref PubMed Scopus (985) Google Scholar). However, core histone acetylation alone does not necessarily account for maximal activation, suggesting the possibility of alternative mechanisms. Posttranslational acetylation of p53 at its C-terminal domain has been demonstrated in several independent studies (4.Gu W. Roeder R.G. Cell. 1997; 90: 595-606Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2212) Google Scholar, 8.Sakaguchi K. Herrera J.E. Saito S. Miki T. Bustin M. Vassilev A. Anderson C.W. Appella E. Genes Dev. 1998; 12: 2831-2841Crossref PubMed Scopus (1036) Google Scholar, 9.Liu L. Scolnick D.M. Trievel R.C. Zhang H.B. Marmorstein R. Halazonetis T.D. Berger S.L. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 1202-1209Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar). Distinct lysines within p53 were found to be acetylated by p300/CBP (Lys-373 and Lys-382) and PCAF (p300/CBPassociated factor) (Lys-320) both in vitro and in vivo. Acetylation of p53 greatly enhances its sequence-specific DNA binding activity and is induced in response to DNA damage (4.Gu W. Roeder R.G. Cell. 1997; 90: 595-606Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2212) Google Scholar, 8.Sakaguchi K. Herrera J.E. Saito S. Miki T. Bustin M. Vassilev A. Anderson C.W. Appella E. Genes Dev. 1998; 12: 2831-2841Crossref PubMed Scopus (1036) Google Scholar, 9.Liu L. Scolnick D.M. Trievel R.C. Zhang H.B. Marmorstein R. Halazonetis T.D. Berger S.L. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 1202-1209Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar). In addition to p53, a growing number of non-histone transcription factors were found to be acetylated by histone acetyltransferases. These include general transcription factors TFIIEβ and TFIIF (10.Imhof A. Yang X.J. Ogryzko V.V. Nakatani Y. Wolffe A.P. Ge H. Curr. Biol. 1997; 7: 689-692Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (540) Google Scholar), GATA-1 (11.Boyes J. Byfield P. Nakatani Y. Ogryzko V. Nature. 1998; 396: 594-598Crossref PubMed Scopus (638) Google Scholar), EKLF (erythroidKrüppel-like factor) (12.Zhang W. Bieker J.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 9855-9860Crossref PubMed Scopus (328) Google Scholar), the Xenopus NF-Y (13.Li Q. Herrler M. Landsberger N. Kaludov N. Ogryzko V.V. Nakatani Y. Wolffe A.P. EMBO J. 1998; 17: 6300-6315Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar), TCF (Tcellfactor) (14.Waltzer L. Bienz M. Nature. 1998; 395: 521-525Crossref PubMed Scopus (327) Google Scholar), HMGI(Y) (15.Munshi N. Merika M. Yie J. Senger K. Chen G. Thanos D. Mol. Cell. 1998; 2: 457-467Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar), HIV Tat protein (16.Kiernan R.E. Vanhulle C. Schiltz L. Adam E. Xiao H. Maudoux F. Calomme C. Burny A. Nakatani Y. Jeang K.T. Benkirane M. Van Lint C. EMBO J. 1999; 18: 6106-6118Crossref PubMed Scopus (366) Google Scholar), c-Myb (17.Tomita A. Towatari M. Tsuzuki S. Hayakawa F. Kosugi H. Tamai K. Miyazaki T. Kinoshita T. Saito H. Oncogene. 2000; 19: 444-451Crossref PubMed Scopus (109) Google Scholar), and the most recently identified E2F1 (18.Martinez-Balbas M.A. Bauer U.M. Nielsen S.J. Brehm A. Kouzarides T. EMBO J. 2000; 19: 662-671Crossref PubMed Scopus (576) Google Scholar). Most of these modifications are functionally relevant in vitro andin vivo. Since histone acetylation is a reversible reaction controlled by the steady level of histone acetyltransferases and histone deacetylases (7.Workman J.L. Kingston R.E. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 545-579Crossref PubMed Scopus (985) Google Scholar), we wonder if factor acetylation (FAT) (4.Gu W. Roeder R.G. Cell. 1997; 90: 595-606Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2212) Google Scholar) is regulated by histone deacetylases as well (factor deacetylation, FDAC). Histone deacetylases are active components of transcriptional corepressor complexes (19.Ayer D.E. Trends Cell Biol. 1999; 9: 193-198Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (253) Google Scholar, 20.Ng H.H. Bird A. Trends Biochem. Sci. 2000; 25: 121-126Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (384) Google Scholar). At least five yeast and six human HDAC enzymes exist. In higher eukaryotes, HDAC1 was first purified using an affinity matrix based on the deacetylase inhibitor trapoxin (21.Taunton J. Hassig C.A. Schreiber S.L. Science. 1996; 272: 408-411Crossref PubMed Scopus (1569) Google Scholar). At the same time, mouse and human HDAC2 was identified based on a yeast two-hybrid screening using YY1 transcription factor as bait (22.Yang W.M. Inouye C. Zeng Y. Bearss D. Seto E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 12845-12850Crossref PubMed Scopus (489) Google Scholar). YY1 negatively regulates transcription by tethering HDAC2 to DNA as a corepressor. Both HDAC1 and HDAC2 associate stably with mSin3A in mediating transcriptional repression. This HDAC-mSin3 complex can be recruited to specific promoters via interactions with a growing number of sequence-specific transcription factors (19.Ayer D.E. Trends Cell Biol. 1999; 9: 193-198Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (253) Google Scholar, 20.Ng H.H. Bird A. Trends Biochem. Sci. 2000; 25: 121-126Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (384) Google Scholar). These include unliganded nuclear hormone receptors (e.g. RAR and TR), Mad/Max and Mxi/Max heterodimer (23.Pazin M.J. Kadonaga J.T. Cell. 1997; 89: 325-328Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (773) Google Scholar), MeCP2 (24.Ng H.H. Bird A. Curr. Opin. Genet. & Dev. 1999; 9: 158-163Crossref PubMed Scopus (544) Google Scholar), and p53 (25.Murphy M. Ahn J. Walker K.K. Hoffman W.H. Evans R.M. Levine A.J. George D.L. Genes Dev. 1999; 13: 2490-2501Crossref PubMed Scopus (395) Google Scholar). As well as being associated with mSin3A, HDAC1/2 are components of the NuRD (nucleosome-remodeling histonedeacetylase) complex which has been implicated a role in transcriptional repression by DNA methylation (26.Zhang Y. Ng H.H. Erdjument B.H. Tempst P. Bird A. Reinberg D. Genes Dev. 1999; 13: 1924-1935Crossref PubMed Scopus (938) Google Scholar, 27.Wade P.A. Gegonne A. Jones P.L. Ballestar E. Aubry F. Wolffe A.P. Nat. Genet. 1999; 23: 62-66Crossref PubMed Scopus (720) Google Scholar). Mammalian HDAC3 was cloned by the searches of EST data bases (28.Yang W.M. Yao Y.L. Sun J.M. Davie J.R. Seto E. J. Biol. Chem. 1997; 272: 28001-28007Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (406) Google Scholar, 29.Emiliani S. Fischle W. Van-Lint C. Al-Abed Y. Verdin E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 2795-2800Crossref PubMed Scopus (278) Google Scholar) and found to repress YY1-mediated transcriptional repression via direct interactions with YY1 (28.Yang W.M. Yao Y.L. Sun J.M. Davie J.R. Seto E. J. Biol. Chem. 1997; 272: 28001-28007Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (406) Google Scholar). Searches of EST data bases led to the discovery of three more histone deacetylases HDAC4, HDAC5, and HDAC6 (30.Grozinger C.M. Hassig C.A. Schreiber S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 4868-4873Crossref PubMed Scopus (671) Google Scholar, 31.Verdel A. Khochbin S. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2440-2445Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (218) Google Scholar, 32.Fischle W. Emiliani S. Hendzel M.J. Nagase T. Nomura N. Voelter W. Verdin E. J. Biol. Chem. 1999; 274: 11713-11720Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (212) Google Scholar, 33.Miska E.A. Karlsson C. Langley E. Nielsen S.J. Pines J. Kouzarides T. EMBO J. 1999; 18: 5099-5107Crossref PubMed Scopus (476) Google Scholar). Sequence alignment analysis reveals that the mammalian HDACs identified so far fall into two groups, the yeast RPD3 protein-like (HDAC1, -2, and -3) and the yeast HDA1 protein-like (HDAC4, -5, and -6) (21.Taunton J. Hassig C.A. Schreiber S.L. Science. 1996; 272: 408-411Crossref PubMed Scopus (1569) Google Scholar, 30.Grozinger C.M. Hassig C.A. Schreiber S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 4868-4873Crossref PubMed Scopus (671) Google Scholar, 33.Miska E.A. Karlsson C. Langley E. Nielsen S.J. Pines J. Kouzarides T. EMBO J. 1999; 18: 5099-5107Crossref PubMed Scopus (476) Google Scholar). It is becoming evident that each group of HDACs is utilized by distinct sets of transcriptional repressors (20.Ng H.H. Bird A. Trends Biochem. Sci. 2000; 25: 121-126Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (384) Google Scholar). Whether HDACs play a role in regulating p53 function remains unaddressed. In the discovery of HIV Tat acetylation (16.Kiernan R.E. Vanhulle C. Schiltz L. Adam E. Xiao H. Maudoux F. Calomme C. Burny A. Nakatani Y. Jeang K.T. Benkirane M. Van Lint C. EMBO J. 1999; 18: 6106-6118Crossref PubMed Scopus (366) Google Scholar), treatment of cells with histone deacetylase inhibitor TSA (34.Yoshida M. Kijima M. Akita M. Beppu T. J. Biol. Chem. 1990; 265: 17174-17179Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) was found to synergistically work with Tat in activating HIV-1 promoter, presumably through inhibiting the deacetylation of Tat. Furthermore, it was found that the retinoblastoma (Rb)-associated histone deacetylase could deacetylate E2F1 (18.Martinez-Balbas M.A. Bauer U.M. Nielsen S.J. Brehm A. Kouzarides T. EMBO J. 2000; 19: 662-671Crossref PubMed Scopus (576) Google Scholar). These studies raise the possibility that, similar to Tat and E2F1, modification of p53 by HDACs might play a direct role in regulating p53 function. In support of this hypothesis, in the course of studying the transcriptional repression function of p53 in apoptosis, Murphy et al. (25.Murphy M. Ahn J. Walker K.K. Hoffman W.H. Evans R.M. Levine A.J. George D.L. Genes Dev. 1999; 13: 2490-2501Crossref PubMed Scopus (395) Google Scholar) found p53 recruited HDACs, via interactions with mSin3A, to repress two genes,Map4 and stathmin. The underlying mechanism at least involves core histone deacetylation. However, the possibility of p53 deacetylation has not been examined. In the present study, we report that mammalian HDAC1, -2, and -3 specifically down-regulate the transactivation activity of p53. The inhibition is HDAC dosage-dependent and requires the deacetylase activity of HDACs. Most importantly, the down-regulation of p53 function by HDACs relies largely on the C-terminal 30 residues of p53, the region containing the basic lysines (Lys-373 and Lys-382) that have been shown to be acetylated by p300/CBP in vivo (4.Gu W. Roeder R.G. Cell. 1997; 90: 595-606Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2212) Google Scholar, 8.Sakaguchi K. Herrera J.E. Saito S. Miki T. Bustin M. Vassilev A. Anderson C.W. Appella E. Genes Dev. 1998; 12: 2831-2841Crossref PubMed Scopus (1036) Google Scholar, 9.Liu L. Scolnick D.M. Trievel R.C. Zhang H.B. Marmorstein R. Halazonetis T.D. Berger S.L. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 1202-1209Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar). These results of functional assays are further supported by the fact that HDACs form a complex with p53 and significantly deacetylate p53 bothin vitro and in vivo. Finally, we show that HDACs inhibit the activity of BAX promoter, a nature system responsive to p53, in a p53-dependent manner. Our findings strongly suggest that HDAC1, -2, and -3 participate in p53-mediated gene regulation, at least in part by directly deacetylating p53. The following plasmids have been described previously: pSVp53V143A and pSVp53V143ACD30, both of which express temperature-sensitive derivatives of p53V143A (35.Tsai H.L. Kou G.H. Chen S.C. Wu C.W. Lin Y.S. J. Biol. Chem. 1996; 271: 3534-3540Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (98) Google Scholar), the p53 reporter construct p3PREcCAT (35.Tsai H.L. Kou G.H. Chen S.C. Wu C.W. Lin Y.S. J. Biol. Chem. 1996; 271: 3534-3540Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (98) Google Scholar); pME18S-FLAG-HDAC2, which expresses FLAG epitope-tagged HDAC2 (36.Laherty C.D. Yang W.M. Sun J.M. Davie J.R. Seto E. Eisenman R.N. Cell. 1997; 89: 349-356Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (858) Google Scholar); pCMV-FLAG-HDAC3, which expresses FLAG epitope-tagged HDAC3 (28.Yang W.M. Yao Y.L. Sun J.M. Davie J.R. Seto E. J. Biol. Chem. 1997; 272: 28001-28007Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (406) Google Scholar); pFLAG-HDAC1(H199F) and pFLAG-HDAC1(H141A), both of which express FLAG epitope-tagged mutant HDAC1 defective in deacetylase activity (37.Hassig C.A. Tong J.K. Fleischer T.C. Owa T. Grable P.G. Ayer D.E. Schreiber S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 3519-3524Crossref PubMed Scopus (334) Google Scholar); pSGVP, which expresses GAL4VP16, and pG5E1BCAT (38.Lillie J.W. Green M.R. Nature. 1989; 338: 39-44Crossref PubMed Scopus (622) Google Scholar); pGST-HDAC1, pGST-HDAC2, and pGST-HDAC3 (28.Yang W.M. Yao Y.L. Sun J.M. Davie J.R. Seto E. J. Biol. Chem. 1997; 272: 28001-28007Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (406) Google Scholar); pBAX-Luc (39.Miyashita T. Reed J.C. Cell. 1995; 80: 293-299Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (305) Google Scholar). To construct plasmid pcDNA3-HDAC1-FLAG, which encodes a C-terminal FLAG epitope-tagged HDAC1, the BamHI fragment from pBJ5-HD1-F (21.Taunton J. Hassig C.A. Schreiber S.L. Science. 1996; 272: 408-411Crossref PubMed Scopus (1569) Google Scholar) was subcloned into the BamHI site of pcDNA3 (Invitrogen). Plasmid pME18S-FLAG-HDAC2-(1–372), which encodes FLAG epitope-tagged mutant HDAC2 defective in deacetylase activity, was created by digestion of plasmid pGEM7Zf-mRPD3 (22.Yang W.M. Inouye C. Zeng Y. Bearss D. Seto E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 12845-12850Crossref PubMed Scopus (489) Google Scholar) withSnaBI and BamHI, followed by fill-in and self-ligation. A further digestion of the resulting plasmid withEcoRI and BglII was performed followed by subcloning of the cut out fragment into pME18S-FLAG (40.Takebe Y. Seiki M. Fujisawa J. Hoy P. Yokota K. Arai K. Yoshida M. Arai N. Mol. Cell. Biol. 1988; 8: 466-472Crossref PubMed Google Scholar). Plasmid pME18S-HDAC3-(1–180), which encodes FLAG epitope-tagged mutant HDAC3 defective in deacetylase activity, was constructed by digestion of the plasmid pBS-SK-HDAC3-(1–428) with HindIII. The cut out fragment was subsequently cloned into pME18S-FLAG vector (40.Takebe Y. Seiki M. Fujisawa J. Hoy P. Yokota K. Arai K. Yoshida M. Arai N. Mol. Cell. Biol. 1988; 8: 466-472Crossref PubMed Google Scholar) betweenEcoRI and XhoI sites. pGEM3-p53 was created by subcloning of the cDNA corresponding to p53 sequence into pGEM3 vector (Promega) between HindIII and BamHI sites. The human lung carcinoma cells H1299 and the human osteosarcoma cells Saos-2 were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium with 10% fetal calf serum. Approximately 2.5 × 105 cells (H1299) or 7.5 × 105 cells (Saos-2) were seeded in each 60-mm culture dish 18–24 h before transfection. Calcium phosphate-mediated DNA transfection was performed as described previously with some modifications (41.Hsu Y.S. Tang F.M. Liu W.L. Chuang J.Y. Lai M.Y. Lin Y.S. J. Biol. Chem. 1995; 270: 6966-6974Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (26) Google Scholar). Typically, transfection lasted 18 h. CAT activity was measured 72 h after transfection and quantified as described previously (41.Hsu Y.S. Tang F.M. Liu W.L. Chuang J.Y. Lai M.Y. Lin Y.S. J. Biol. Chem. 1995; 270: 6966-6974Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (26) Google Scholar). For temperature shift assays, the incubation temperature was switched to 30 °C for 24 h after incubation at 37 °C for 48 h. For luciferase assays, cell culture and DNA transfection were done as described above except that 0.5 μg of pBAX-Luc, 0.1 μg of pRL-TK, 0.5 μg of pSVp53V143A, and 2.5 μg of plasmids encoding HDACs were introduced into cells. After harvesting the cells, the luciferase activity was determined using the Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega). An equal amount (approximately 10 μg) of proteins from extracts of transfected cells was boiled in a sample buffer (125 mm Tris-HCl, pH 6.8, 100 mmdithiothreitol, 2% SDS, 20% glycerol, 0.005% bromphenol blue) for 5 min and then loaded onto a 12% SDS-polyacrylamide gel. After electrophoresis, proteins were transferred to an Immobilon membrane (Millipore). p53, FLAG-HDAC derivatives were detected with antibodies directed against p53 (Ab-6, Oncogene) and FLAG epitope (Sigma), respectively, using the ECL system (Amersham Pharmacia Biotech) according to the manufacturer's instructions. In vitrotranscription/translation was performed with the TNT system (Promega) according to the manufacturer's instructions. The template was pGEM3-p53. GST, GST-p53, GST-HDAC1, GST-HDAC2, and GST-HDAC3 were expressed in and purified fromEscherichia coli BL21DE3pLysS strain according to standard protocols (42.Smith D.B. Johnson K.S. Gene (Amst.). 1988; 67: 31-40Crossref PubMed Scopus (5768) Google Scholar, 43.Lin Y.S. Green M.R. Cell. 1991; 64: 971-981Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (467) Google Scholar, 44.Lin Y.S. Ha I. Maldonado E. Reinberg D. Green M.R. Nature. 1991; 353: 569-571Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar). The ligand concentrations, using bovine serum albumin as a standard, were 14 mg/ml GST beads and 0.3 mg/ml each of GST-HDAC1, GST-HDAC2, and GST-HDAC3 beads. Aliquots (50 μl, ∼15 μg of proteins on beads) of the GST, GST-HDAC1, GST-HDAC2, and GST-HDAC3 beads were incubated overnight at 4 °C with in vitro translated, [35S]methionine-labeled p53. After being washed with buffer D (45.Dignam J.D. Lebovitz R.M. Roeder R.G. Nucleic Acids Res. 1983; 11: 1475-1489Crossref PubMed Scopus (10327) Google Scholar), bound proteins were eluted from beads with buffer D containing 0.1 m glutathione and analyzed by electrophoresis on a 10% SDS-polyacrylamide gel. Approximately 5 × 105cells were seeded in each 100-mm culture dish 18–24 h before transfection. Cell cultures and DNA transfections were performed as described above. Briefly, 20 μg each of the corresponding plasmids was transfected into H1299 cells. Cell extracts were prepared by lysis in Nonidet P-40 buffer (20 mm Tris-HCl, pH 7.2, 100 mm NaCl, 10% glycerol, 0.1% Nonidet P-40, 1 mm EDTA) containing 1× protease inhibitor mixture (CompleteTM, Roche Molecular Biochemicals). Equal amounts of lysates were incubated with antiserum (1:100 dilution) overnight at 4 °C, followed by 2 h precipitation with protein A/G-agarose beads (Calbiochem). All immunoprecipitates were washed three times with Nonidet P-40 buffer. Bound proteins were eluted from the affinity matrix in SDS loading buffer and separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, followed by Western blotting analysis described above. Primary antibodies for Western were anti-FLAG (Sigma) at 1:400 dilution, anti-p53 (Ab-6, Calbiochem) at 1:2000 dilution, anti-Ace p53 (Lys-373 and Lys-382) (Upstate Biotechnology Inc.) at 1:500 dilution. Peptides corresponding to the C-terminal 26 amino acids of p53 (residues 364–389, 5′-AHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEG-3′) or the N-terminal fragment of histone H4 (5′-SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR-3′) were synthesized by the core facility center of the Institute of Zoology, Academia Sinica, and purified to 95% purity by high pressure liquid chromatography. To acetylate the peptides, 0.4 mg of peptides were incubated with 0.5 ml of [3H]CH3COONa (NEN Life Science Products, catalog number NET-003H, 5 mCi (185 Mbq), 2–5 Ci (74.0–185 Gbq)/mmol in ethanol) and 10 μl of BOP (BOP solution is always prepared freshly. For 100 μl of BOP solution, take 0.01 g of BOP (Aldrich catalog number 22,608-4) into 97 μl of acetonitrile (Aldrich catalog number 27,071-7) at room temperature overnight with stirring. After mixing well to dissolve, 3 μl of triethylamine (Aldrich catalog number 13,206-3) was added and mixed thoroughly. The final concentration for BOP and triethylamine were 0.24 m and 0.2m, respectively. This labeling was processed in the chemical hood. To purify the radiolabeled peptides, the Microcon-SCX (Millipore catalog number 42460) was prewashed with 500 μl of 10 mm HCl in methanol once and then with 500 μl of 10 mm HCl, 10 mm methanol in double distilled water. An aliquot (250 μl) of the labeling mixture was loaded onto the prewashed Microcon-SCX column and then spun at 1200 ×g for 1 min. The column was then washed twice with 500 μl of 10 mm HCl in 10% methanol, followed by centrifugation at 1200 × g for 1 min. To elute the sample, 50 μl of 3 n HCl in 50% isopropyl alcohol was added to the reversed column, followed by centrifugation at 14,000 × g for 15 s. Finally, the elute was dried out and dissolved into 500 μl of double distilled water and stored at −80 °C. To evaluate the successful labeling, 1 μl of the purified peptide was taken into 100 μl of water and extracted with 400 μl of ethyl acetate for scintillation counting. The counts were adjusted to 20,000 cpm for each peptide deacetylase assay. H1299 cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium with 10% fetal bovine serum. For transfection, 5 × 106 cells were seeded in a 100-mm culture dish for 16 h. Twenty μg of pcDNA3-HDAC1-FLAG was introduced into cells with the calcium phosphate coprecipitation method as described (41.Hsu Y.S. Tang F.M. Liu W.L. Chuang J.Y. Lai M.Y. Lin Y.S. J. Biol. Chem. 1995; 270: 6966-6974Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (26) Google Scholar). 72 h after transfections, cells were harvested, lysed in Jurkat lysis buffer (37.Hassig C.A. Tong J.K. Fleischer T.C. Owa T. Grable P.G. Ayer D.E. Schreiber S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 3519-3524Crossref PubMed Scopus (334) Google Scholar). Immunoprecipitation of the HDAC1 immunocomplex with FLAG antibodies (Sigma) was performed as described (37.Hassig C.A. Tong J.K. Fleischer T.C. Owa T. Grable P.G. Ayer D.E. Schreiber S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 3519-3524Crossref PubMed Scopus (334) Google Scholar). The precipitated HDAC1 complex was stored in 150 μl of ice-cold HD buffer (20 mm Tris, pH 8.0, 150 mm NaCl, 10% glycerol) and subsequently used in the deacetylase reactions as described with some modifications (28.Yang W.M. Yao Y.L. Sun J.M. Davie J.R. Seto E. J. Biol. Chem. 1997; 272: 28001-28007Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (406) Google Scholar). Briefly, 20,000 cpm of purified peptides were incubated with immunoprecipitates in 150 μl of ice-cold HD buffer at room temperature overnight with mild shaking. To stop the reactions, 50 μl of STOP solution (0.16 m acetic acid, 1.0 m HCl) was added into each reaction and mixed well by vortexing. The released [3H]acetate was extracted by adding 600 μl of ethyl acetate. 250 μl of upper layer was mixed with 5 ml of scintillation mixture to detect the HD activity. Regulation of p53 function by posttranslational acetylation has been demonstrated by several laboratories (4.Gu W. Roeder R.G. Cell. 1997; 90: 595-606Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2212) Google Scholar, 8.Sakaguchi K. Herrera J.E. Saito S. Miki T. Bustin M. Vassilev A. Anderson C.W. Appella E. Genes Dev. 1998; 12: 2831-2841Crossref PubMed Scopus (1036) Google Scholar, 9.Liu L. Scolnick D.M. Trievel R.C. Zhang H.B. Marmorstein R. Halazonetis T.D. Berger S.L. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 1202-1209Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar). A recent finding by Murphy et al. (25.Murphy M. Ahn J. Walker K.K. Hoffman W.H. Evans R.M. Levine A.J. George D.L. Genes Dev. 1999; 13: 2490-2501Crossref PubMed Scopus (395) Google Scholar) further indicates that p53 utilizes HDACs, basically through histone deacetylation, to repress the transcription of two genes, Map4 andstathmin. However, question as to whether deacetylation of p53 itself plays a role has not yet been addressed. To assess the possibility of HDACs in regulating p53 function, a CAT reporter construct p3PREcCAT (35.Tsai H.L. Kou G.H. Chen S.C. Wu C.W. Lin Y.S. J. Biol. Chem. 1996; 271: 3534-3540Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (98) Google Scholar) containing threep53-responsive elements (PRE) (46.Ginsberg D. Mechta F. Yaniv M. Oren M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 9979-9983Crossref PubMed Scopus (422) Google Scholar) was transiently transfected into cells, in the absence or presence of expression plasmids encoding p53 or HDACs. Since p53 has been shown to inhibit the activities of promoters lacking PREs, we took advantage of

YY1 is a sequence-specific DNA-binding transcription factor that has many important biological roles.It activates or represses many genes during cell growth and differentiation and is also required for the normal development of mammalian embryos.Previous studies have established that YY1 interacts with histone acetyltransferases p300 and CREB-binding protein (CBP) and histone deacetylase 1 (HDAC1), HDAC2, and HDAC3.Here, we present evidence that the activity of YY1 is regulated through acetylation by p300 and PCAF and through deacetylation by HDACs.YY1 was acetylated in two regions: both p300 and PCAF acetylated the central glycine-lysine-rich domain of residues 170 to 200, and PCAF also acetylated YY1 at the C-terminal DNA-binding zinc finger domain.Acetylation of the central region was required for the full transcriptional repressor activity of YY1 and targeted YY1 for active deacetylation by HDACs.However, the C-terminal region of YY1 could not be deacetylated.Rather, the acetylated C-terminal region interacted with HDACs, which resulted in stable HDAC activity associated with the YY1 protein.Finally, acetylation of the C-terminal zinc finger domain decreased the DNA-binding activity of YY1.Our findings suggest that in the natural context, YY1 activity is regulated through intricate mechanisms involving negative feedback loops, histone deacetylation, and recognition of the cognate DNA sequence affected by acetylation and deacetylation of the YY1 protein.

Abstract Promyelocytic leukemia nuclear bodies (PML-NBs) are PML-based nuclear structures that regulate various cellular processes. SUMOylation, the process of covalently conjugating small ubiquitin-like modifiers (SUMOs), is required for both the formation and the disruption of PML-NBs. However, detailed mechanisms of how SUMOylation regulates these processes remain unknown. Here we report that SUMO5, a novel SUMO variant, mediates the growth and disruption of PML-NBs. PolySUMO5 conjugation of PML at lysine 160 facilitates recruitment of PML-NB components, which enlarges PML-NBs. SUMO5 also increases polySUMO2/3 conjugation of PML, resulting in RNF4-mediated disruption of PML-NBs. The acute promyelocytic leukemia oncoprotein PML-RARα blocks SUMO5 conjugation of PML, causing cytoplasmic displacement of PML and disruption of PML-NBs. Our work not only identifies a new member of the SUMO family but also reveals the mechanistic basis of the PML-NB life cycle in human cells.

Abstract Heterochromatin, a type of condensed DNA in eukaryotic cells, has two main categories: Constitutive heterochromatin, which contains H3K9 methylation, and facultative heterochromatin, which contains H3K27 methylation. Methylated H3K9 and H3K27 serve as docking sites for chromodomain-containing proteins that compact chromatin. M33 (also known as CBX2) is a chromodomain-containing protein that binds H3K27me3 and compacts chromatin in vitro. However, whether M33 mediates chromatin compaction in cellulo remains unknown. Here we show that M33 compacts chromatin into DAPI-intense heterochromatin domains in cells. The formation of these heterochromatin domains requires H3K27me3, which recruits M33 to form nuclear bodies. G9a and SUV39H1 are sequentially recruited into M33 nuclear bodies to create H3K9 methylated chromatin in a process that is independent of HP1α. Finally, M33 decreases progerin-induced nuclear envelope disruption caused by loss of heterochromatin. Our findings demonstrate that M33 mediates the formation of condensed chromatin by forming nuclear bodies containing both H3K27me3 and H3K9me3. Our model of M33-dependent chromatin condensation suggests H3K27 methylation corroborates with H3K9 methylation during the formation of facultative heterochromatin and provides the theoretical basis for developing novel therapies to treat heterochromatin-related diseases. Keywords: H3K27 methylation; H3K9 methylation; Heterochromatin; M33 (CBX2); Nuclear body (NB); Progerin.